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荧光标记的siRNA

我们可对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记。标记后的siRNA可用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等观察到,确定转染效率,优化转染条件;标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

产品描述

我们可对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记,反义链5'端标记会影响其基因沉默活性,所以不推荐在这一位点进行标记,在其他三个末端修饰对沉默活性几乎没有影响。我们推荐在正义链的5'端修饰,目前公认这是最佳的化学标记位点。

siRNA标记的荧光基团染料大体上有3类:6-羧基荧光素染料,花青素染料和罗丹明染料,吉玛基因能为客户提供多品种类修饰的荧光标记。

荧光素染料修饰: 5'-Fluorescein CE Phosphoramidite (6-Fam),颜色:Green/yellow。

                           5'-Tetrachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (TET),颜色:Orange/yellow。 

                           5’-Hexachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (HEX),颜色:Pink。

1. FAM/TET/HEX 是最常用的荧光染料,化学合成简单,收率高,能够帮助优化各种细胞的转染条件,跟踪RNA在细胞或者动物的位置分布。

2. 荧光的最佳工作PH值范围在7.5~8.3 .

3. FAM/TET/HEX标记的Oligo要避光 ,干粉,-20℃贮存,不可以在氨水中。

花青素染料修饰: Quasar570 CE Phosphoramidite (Cy3),颜色:Dark pink/Red。

                           Quasar670 CE Phosphoramidite  (Cy5),颜色:Far red。

1. 本公司是以Quasar染料代替Cy染料修饰,属花青素染料类,深粉红色,它们的吸收波长和激发波长相似. Quasar染料比CY类标计的Oligo要更稳定。

2. 具有稳定的荧光,能够帮助优化各种细胞的转染条件,跟踪RNA在细胞或者动物的位置分布。

罗丹明染料修饰:CAL Fluor Red 610  CE phosphoramidite, 颜色:Orange/red。

                         TAMRA,颜色:Red。

1. CAL Fluor Red 610可以作为Texas Red(德克萨斯红)或ROX dyes的替代物与BHQ-2配合使用。

2. TAMRA 既可做发光基团又可做淬灭基团,由于TAMRA发射光谱比较宽,一般用作淬灭基团

各种荧光染料的激发波长和吸收波长见下表:

Dye Absorption wavelength Emission wavelength Colour
FAM 495 520 Green/yellow
TET 525 550 Orange/yellow
HEX 535 565 Pink
Quasar 570(cy3) 550 570 Dark pink/Red
TAMRA 550 575 Red
ROX 580 605 Purple
CAL Fluor Red 610 590 610 Orange /red
Quasar 670(cy5) 650 670 Far red

本公司提供的siRNA相关产品直接作用于靶基因mRNA,因此我们建议您在收到我们的相关产品后先进行实时定量PCR检测,以确定靶基因mRNA表达水平的变化,进而直接确认我们合成或构建的siRNA产品是否有效 .

功能介绍与实验实例

siRNA Real-Time PCR结果分析

对于RNAi实验而言,我们通常需要知道的是某一特定细胞在导入siRNA前后某一特定基因的表达变化情况来判断siRNA起到了Gene Knockdown作用。应用荧光定量PCR的方法,可以通过两种途径来实现上述判断,一是测定特定细胞在导入siRNA前后某一特定基因mRNA数量的变化,即为绝对定量;二是通过检测特定基因与某一管家基因在在导入siRNA前后相对表达情况的变化,即为相对定量。通常采用相对定量的方法来检测siRNA的Gene Knockdown作用。

1.Real-Time PCR 实验设计

Real-Time PCR实验设计时应包括实验组(导入siRNA),阴性对照(Negative Control)和Mock Transfaction三组。每组至少三个重复。各组同时检测目标基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH为管家基因。



2.Real-Time PCR得到siRNA导入前后目标基因和管家基因的Ct值

各组重复实验的Ct值差异不能过大;一般地,重复实验Ct值差异在1以内是可以接受的。



实验组 阴性对照(NC) Mock Transfection
Target Gene GAPDH Target Gene GAPDH Target Gene GAPDH
30.40 23.63 24.21 22.66 26.21 24.60
30.35 23.40 24.60 22.56 26.15 24.31
30.41 23.52 24.66 22.48 26.35 24.72


3.Real-Time PCR数据分析

以Mock Tansfection为对照(Calibrator),管家基因为Normalizer,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-( Ct目的基因- Ct管家基因)对照
Target Gene GAPDH ΔCt ΔΔCt Target Gene
Average Ct Average Ct Target Gene–GAPDH ΔCt–ΔCt, Mock Rel. to Mock
Mock 26.24±0.10 24.54±0.21 1.7±0.21 0.00±0.21 1.0(1.16-0.86)
实验组 30.39±0.09*1 23.51±0.15*2 6.88±0.17*3 5.18±0.17 0.027(0.0240.031)
NC 24.49±0.24 22.56±0.09 1.93±0.25 0.23±0.25 0.85(0.71-1.01)
注:*1 为同一样本重复实验的Ct值的标准偏差,可用Excel 计算得到; 
*2 计算公式为 ,例如 =0.17
*3 计算公式为2△△Ct+S 和2△△CtS,S为△△Ct的标准偏差,例如 2(2.5+0.10) =5.3



使用方法

一、荧光标记的siRNA

转染效率的高低可以通过荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)实现。 
FAM-siRNA 转染细胞后,可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测,确定是否有效转染和优化转染条件。FAM-siRNA 还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。 

二、使用荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)检测转染效率 

1 FAM-siRNA的溶解及保存 
1.1 由于OligoRNA很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开离心管前先离心,然后再慢慢打开管盖,溶解时加适量DEPC水后盖上管盖,振荡溶解。 
1.2 需要浓度20uM的样品,如何计算重悬siRNA缓冲液的量?你购买了1OD的siRNA,想溶解为20uM 的样品,应该使用150ul附送的DEPC水去重悬1OD的siRNA,溶解后为20uM的样品。 
1.3 贮存和稳定性:-20℃,避光保存,冻干粉或液体。液体(贮存浓度为20μM)避免反复冻融,GenePharma保证在上述条件下siRNA oligo的稳定性可达到6个月。 

2 转染 
2.1 使用lipofectamin2000 转染的步骤(以贴壁细胞为例,仅供参考) 
(1)以24孔培养板操作为例(其他孔板各种的试剂用量,请参照“Lipofectamine2000 manual”),转染前一天,将0.5~2X105个细胞接种于培养板中,每孔中加入约500ul无抗生素的培养基,使转染时的细胞密度能够达到30~50%; 
(2) 取1μl/孔 Lipofectamine2000(使用前轻轻摇匀),用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释。轻轻混和后在室温孵育5 min; 
(3) 取2ul FAM-siRNA,用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释,轻轻混和均匀;
(4) 稀释的Lipofectamine2000(2)经过5min 的孵育后,与稀释FAM-siRNA(3)轻轻混和,室温静置20min,以形成FAM-siRNA-转染试剂混和物,如果溶液出现浑浊,属于正常现象,不会影响转染效果。 
注意:稀释的Lipofectamine2000(2)尽量在25min 之内,和稀释的FAM-siRNA 混和,如果放置时间过长,可能导致转染试剂活性的降低;
(5) 将FAM-siRNA-转染试剂混和液(4)加入含有细胞及培养液(约含400ul)的孔中,轻轻摇晃孔板,使混和; 
(6) 在37 ℃的CO2 培养箱中培养,4-6 小时后可将培养基换为含血清的完全培养基(该步骤可以省略);
(7)转染6小时后即可检测转染效率:流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等(见后面)。 

2.2 转染操作注意事项: 

(1)FAM-siRNA 的转染过程和普通siRNA 是一样的,注意整个实验过程要尽量避光,建议转染时室内和超净台内不要开灯; 
(2)保持FAM-siRNA 管外有锡纸包裹,在静置lipo-siRNA 过程中尽量避光, 
(3)转染操作尽量快,操作时间尽量短,操作完毕请尽快将培养板放到培养箱。 
(4)一般来说,使用Lipofectamine 2000 作为转染试剂,4~6 小时就可以保证siRNA 转染进入细胞。因此转染效率的检测可以在转染后6小时(转染过程完成)进行。

3、观察与检测 

3.1 检测方法:荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪 
3.2 荧光显微镜观察注意事项(流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测请参照仪器说明书): 
(1)FAM 是一种绿色荧光基团,由蓝光激发,激发波长480nm,发射波长520nm。 
(2)使用Lipofectamine 2000 转染后6 小时就可以检测,检测前细胞处理等操作都必须避光!对于检测的时间要求相对不是特别严格,成功转染的细胞如果没有受到强光刺激的话,荧光一般不会消失,我们建议尽量在转染后24 小时内完成检测。 
(3)确保熟悉荧光显微镜操作。建议检测时,可以先使光路先对准没有转染FAM -siRNA的孔,调好焦距打开激发光,一切准备就绪后再进行观察(一般情况下可以马上看到荧光)。 
(4)观察时间不宜过长,尽量避免荧光被猝灭,光路对准转染孔,马上观察和拍照。拍完荧光照片后,最好在同一视野中拍下明场的细胞照片。 
(5)只有成功转染的细胞才能看到FAM 绿色荧光,与绿色荧光蛋白GFP 的荧光不太一样,FAM 的荧光比较弱,散在分布在细胞质中。 
(6)由于荧光容易猝灭,应用计数的方法计算转染效率效果不好,最好用流式细胞仪检测。 
(7)如果您对我们FAM-siRNA 质量有任何质疑的话,您可以从中吸取少量(2~5μl)FAM-siRNA,加在载玻片上,盖上盖玻片,直接于荧光显微镜下观察。注意保证FAM-siRNA 的保存和使用方法无误,另外,所有操作都必须在避光条件下进行。

产品说明书

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