GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。

通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。 有可能是引物二聚体的条带

大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的 对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）

在PCR反应体系中第一链产物的含量过高 减少引物的用量 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。 在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。 由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。

最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系 与反应起始时RNA的总量及纯度有关 建议在试验中加入对照RNA 第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10 建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。 目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：  a. 将第一链的反应温度提高至50℃。  b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。

human U6 promoter表达框包括human U6 promoter、终止码TTTTT和中间自行设计的抑制序列或抑制序列的发卡结构。从人基因组中可以扩增出U6 promoter，后面的序列全部自己设计。

可能原因是stem的长度刚好和primer相当，所以primer退火时hairpin结构也形成，从而影响测序。分析一下发现它与stem的长度及序列有关。冷泉港推荐改变sense strand上几个碱基，使其在DNA水平不互补，但RNA却能利用G-U互补形成hairpin。

目前发表的RNAi表达载体大多采用3型Pol III启动子，如human/mouse U6启动子等。其中人U6启动子有几个明显的特点：1.具有TATA box，位于-30~-25bp，被Pol III转录；2.在转录起点上游-66~47bp处存在PSE(proximal sequence element)，该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点；3.在-244~-214存在DSE(distal sequence element)；4.启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号；5.PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6.+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5'-T噑TTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。  如有兴趣可以利用同尾酶设计poly-RNAi表达载体，从而可以观察同时knockdown两个或多个基因表达后产生的效应。若是条件允许，可以对U6启动子进行shuffling，筛选具有特殊用途的突变的Pol III启动子。

因为人工合成siRNA价格太高，现在经常采用RNAi expression vector，抑制序列一般在19-22bp。使用Pol III启动子时转录终止码为5'-TTTTT-3'，而使用Pol II启动子则为polyA。其实这两种终止码都不能完全避免通读(readthrough)现象的发生。现在RNAi多用前者，是因为其较短，不形成复杂的空间结构；后者因为较长，形成的空间结构可能会对抑制序列发卡结构的形成构成空间阻碍或产生遮挡效应。

可以，这些载体都是真核表达载体，根据国外的经验，质粒载体的knockdown作用一般仅持续一周左右，一周后被down的RNA水平即恢复原有水平，其机制尚未阐明。推荐使用逆转录病毒载体达到稳定转染的效果。

上海吉玛的supersilencing shRNA 载体分别使用Pol III依赖H1或者U6的启动子。尽管H1和U6是polⅢ 型启动子，然而可能根据使用细胞系的不同，效率有些小的差别。

使用pol III型启动子是为了有效表达shRNA。这些pol III型启动子包含了表达RNA上游所有的必要的元件，而且在一个短的多聚胸苷区内终止。一旦shRNA被表达，它被转移出细胞核，在细胞质中被Dicer加工成siRNA。Dicer优先识别由 pol III型启动子产生的shRNA，因为它们不带有5’或者3’两侧连接的序列。siRNA进入RISC复合体中，在哺乳动物细胞中产生RNAi效应。

在哺乳动物细胞中，RNAi可以通过直接导入特异阻断所选择基因表达的分子而诱导，导致产生基因功能缺失表型。这些分子可以通过化学合成、体外方法制备或者细胞内DNA模板产生。前两种方法只能用于瞬时阻断，可能很难导入难以转染的、不分裂的或者原代细胞类型。通过载体导入pol III 启动子表达的短的发夹RNA（shRNA）扩展了RNAi实验的选择，包括稳定和可诱导表达以及病毒导入。

最常见的影响沉默效果的两个原因是：转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系，并发现沉默效果不佳，我们建议您对转染效率进行检测，并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在，我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术，这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求，可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。

迄今为止还没有明确的siRNA体内实验使用量的计算方式，在实验前最好先从文献中查询是否已经有相关的文章发表。对于常规实验，一般使用100 μL的注射体积，浓度为10 to 500 μM。原先用antisense的研究表明，当剂量大于20 mg/kg/day (416 mM)时,会观察到明显的毒性。最好针对您的实验绘制剂量反应曲线。 常规情况下，给药剂量可以以 ~5mg/kg/day [~7.7 nmol/day or 100 mM per day]作为优化起点。需要注意的是，这个剂量只是一个预实验的起点，最后的给药剂量取决于动物模型、靶基因、靶组织和给药方式等因素

上海吉玛 的siRNA经过严格HPLC纯化,已经被用户通过局部注射用于小鼠的体内实验,并且得到满意的实验结果。

寡核苷酸可以通过大剂量给药或使用ALZET微小泵持续给药。大剂量给药时要慎重，因为已有研究表明：一些毒性与寡核苷酸反义链的浓度有关，快速给药时可能会导致动物下肢瘫痪或致死，所以给药时要注意观察。很多已发表的论文实验是通过尾静脉给药的。任何给药方式都需要优化，以确保最佳的导入方式和动物的健康。一般拿静脉注射来说，每天注射一到两次，连续注射一到两周。

体内实验设计包含动物模型的选择、给药途径、剂量和给药次数等等。siRNA使用的数量及浓度主要取决于给药靶点的性质，诸如肿瘤的类型，组织的类型，靶基因表达水平，动物模型个体大小等等，针对不同的研究模型，最好先查阅相关资料。

我们推荐RT-PCR的引物应该设计在target位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割，切割导致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。  另外，RT-PCR结果会因为靶基因mRNA降解时间不同、细胞内靶基因mRNA丰度不同而导致假阴性结果，特别对于丰度较高的基因，推荐使用的检测方式包括定量PCR、Northern检测、western检测等。这些方法会更加真实的反映RNAi的结果。

反义核酸和RNAi从作用原理到使用的范围都有很大差异。这里只能做一个简单的介绍：从原理上说，反义核酸是一段与靶基因配对的单链DNA或类似DNA的片段与靶基因结合，结果阻止靶基因的转录或是翻译，以往的研究表明在反义核酸的研究中，序列的有效性和有效序列的非特异性往往有比较高的正相关性，这就在一定程度上限制了反义核酸的应用。  RNAi的作用机理是双链的RNA进入细胞内，导致靶基因的切割和降解。siRNA的序列可以选择在高度特异针对靶基因的位置，也就为RNAi作为药物研究提供了高效、低副作用的空间。自从RNAi技术问世以来，国外很多专业从事反义核酸研究的公司都纷纷转向RNAi研究， ISIS是一个非常就有代表性的例子。他们认为，如果使用反义核酸可以进行的研究，以及反义核酸可以涉及的研究领域，RNAi均可以毫不示弱的开展，并且应该会得到更加令人满意的结果。  我使用合成的双链DNA克隆载体，但是测序结果不正确，是DNA合成的问题，还是其他问题？  首先，质量良好的、并且是退火状态良好的dsDNA是克隆成功的关键因素。一般情况下，需要挑不止一个克隆测序（通常是2个以上），如果两个克隆的序列都是错误的，并且错误的碱基是相同的,那么基本可以确定是DNA oligo合成的问题. 如果两个克隆的不同碱基发生错误，有可能是合成片段本身的问题，也有可能是克隆过程造成的问题，可以再多挑1~2个克隆测序确证。大多数情况下，两个阳性克隆中，一般至少会有一个克隆是正确的，这种个别碱基在个别分子中的错误是合成和克隆过程共同造成的，但一般发生的几率较低。

用RNAi进行pathway研究，是RNAi主要应用之一。在这样的课题中，对照系统的选择尤其重要。已经发表的和已经验证的siRNA为RNA干扰研究提供了系统性对照。用RNAi进行细胞凋亡相关基因的研究，以往已经有众多的文献报道，可以查阅上海吉玛网站www.genepharma.com。

使用什么样的转染方法，很大程度上取决于您使用的细胞系：   1.贴壁的、易转染的细胞，我们推荐使用RNAi-mate；  2.悬浮的或原代的细胞，我们推荐使用电击转化方法；  3.电击转化效率仍然很低的细胞，需要选择载体系统。 上海吉玛除提供化学合成的siRNA以外，还提供完整的载体系统，请参阅产品资料。

如果出现细胞大量死亡，意味着您的转染条件仍然需要优化：  转染条件的优化一般包括以下几个方面：  1. 调整转染试剂的浓度；  2. 在转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液，  3.调整细胞的生长状态；一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性； 4.调整转染试剂和siRNA的比例； 如果同一管转染试剂在不同实验中对细胞的毒性有差异，一般说来应该是实验过程本身带来的差异；  如果已经做了以上几项工作，转染效率仍然得不到提高，建议您更换一种转染试剂。

好的转染试剂有以下特点：1、对siRNA有较高的转染率；2、对细胞的毒性小。在mRNA水平检测siRNA导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。

荧光素在495nm处有最大吸收率，在520nm处有最大发射率。

已经有为数不少的实验室研究过荧光标记的siRNA的荧光检测结果和knockdown效率之间的正相关关系。荧光标记双链是最常用的优化转染条件的方法。可以用流式细胞仪或者荧光共聚焦显微镜检测标记的siRNA。

研究者可以用Beer法则定量RNA：吸光度（260nm）=(摩尔消光系数)*(浓度)*(路径长度,cm)。为了便于理解，等式变为：浓度＝（吸光度,260nm）/[(摩尔消光系数)*(路径长度,cm)]。当使用一个标准的10mm比色皿时，在公式中路径长度这个变量等于1。 6uL浓度为10uM的siRNA溶解液中含有多少ug的siRNA？ 首先计算含有多少nmol的siRNA： a. 等式: nmol = (6 uL)(10 umol/L)；b. 单位换算: nmol = (6 uL)(10 umol/L)(1 L/1,000,000 uL)(1,000 nmol/umol)；c. 答案: nmol = 0.06 nmol。然后利用siRNA的平均分子量（13,300 g/mol）把nmol变为ug：a. 等式: ug = (0.06 nmol)(13,300 g/mol)；b. 单位换算: ug = (0.06nmol)(13,300 g/mol)(1mol/1,000,000,000 nmol)(1,000,000ug/g)；c. 答案: ? ug = 0.798≈0.8 ug。所以6uL浓度为10uM的siRNA溶解液中含有0.8ug的siRNA。 我需要浓度为20uM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？ 样品浓度的计算如下：（siRNA的量，nmol）/（重悬体积，uL）＝样品浓度，umol/L。在解答前应先统一单位，确保单位可以抵消。例如：您购买了20nmol的siRNA，想溶解为50uM的样品。可按以下方法计算重悬缓冲液体积：a. 等式: (20 nmol)/ uL = 50 umol/L；b. 解答未知量: uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)；c. 单位换算: uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)(1 umol/1,000 nmol)(1,000,000 uL/1 L)；d.答案: uL = 400 uL。因此，应该使用400uL缓冲液去重悬20nmol的siRNA，溶解后为50uM的样品。 一定需要阴性对照吗？ 是，阴性对照是RNA干扰实验中不可缺少的。由于在超过200 nM的浓度下，siRNA有可能会导致非特异性的压力反应，在实验体系中必需设置阴性对照。它能够帮助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的RNAi的结果。由于siRNA的合成方法和工艺以及转染试剂等因素可能导致广泛的基因沉默现象。如果没有阴性对照，研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉默当作由RNAi引起的基因特异性沉默。 常用的阴性对照有哪些类型? 常用的阴性对照大体分为两种，一种是使用通用阴性对照序列，该序列已经被上千篇文章使用；另一类是使用和靶基因siRNA打乱序列的siRNA作为阴性对照，这样的阴性对照和通用序列相比较，一方面合是按照定制产品价格合成的，另一方面，由于打乱序列是没有经过验证的序列，有可能会产生off－target现象。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作为阴性对照。 在阴性对照体系中和实验体系中观察到同样的实验结果，这是什么原因？ 这个结果充分说明了设置阴性对照的必要性。该结果表明您所观察到的表型不是序列特异性knockdown产生的表型，您需要降低siRNA的工作浓度。 为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要？ 阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说，当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时，您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。通常最好的阳性对照是内在的对照 你们能提供预先合成的siRNA对照么？ 可以。吉玛能提供许多预先合成的用于RNA干扰实验的对照双链。 用于对照的siRNA的最佳浓度是多少？ 阳性对照和阴性对照的siRNA的浓度都应该与基因特异性的siRNA的浓度相同。 不同工作浓度下1OD siRNA可以使用多少次 工作浓度 1 OD siRNA可以使用孔数（孔） 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 100mm dish 5nM 5000 2500

增加siRNA的浓度一般不能改进沉默效率。高浓度的siRNA将可能导致去靶作用和对细胞的毒性。siRNA的高基因沉默效率来自于合理的设计，在100nM 甚至更低的浓度都可能有75%的沉默效率。另外，低的转染效率会导致低的沉默效率，建议您更进一步优化siRNA的导入条件。

我们建议您用于实验的siRNA的浓度为100nM。1nmol siRNA的量对于一个24孔板或是96孔板的实验已经足够了。

吉玛公司为您提供的siRNA是冻干粉包装的，在常温下运输。这些冻干的样品在室温下能稳定保存2－4个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷冻箱中。

悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。最近研究表明悬垂的组成在mRNA靶识别和酶解中不是很重要。悬垂可能在形成RISC的过程中起结构的作用。很多研究人员选择dTdT是因为研究表明脱氧核糖核苷能保护siRNA免受酶解。合成序列最重要的是确定靶mRNA的19个碱基的核心结构。

您需要准确地提供siRNA的19个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供相应地基因的GeneID或者Accession Number，由我们公司技术人员为您免费设计。

目前RNA寡核苷酸的最大长度是50碱基。

吉玛公司的siRNA是双链的,而且也是按照双链来定价的。

一般siRNA都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。