点突变（point mutation）

简介

点突变是指单个碱基对发生改变的基因突变，利用点突变技术可将人类致病突变位点引入小鼠相对应的原位位点。点突变对基因功能与表型有深远影响，并在各类疾病中起到重要作用。

技术原理

CRISPR或TALEN介导的点突变是指目标位点被切割，DNA双链断裂，在与目标编辑位点高度同源的单链寡核苷酸 (single-stranded oligonucleotide，ssODN) 存在的情况下，细胞使用单链寡核苷酸作为模板，利用同源重组修复（homology-directed repair，HDR）机制介导单链寡核苷酸的插入。

通过这种机制可以实现的点突变包括：

• 单碱基或多碱基突变
• 插入小DNA片段，例如loxP位点、Tag或其他小DNA片段
• ssODN介导的基因组片段（1bp-数kb）精准删除

ssODN介导的基因组片段精准删除示意图

利用 ssODN介导的精准删除：

• 可按研究者的要求精准删除目标蛋白的一个或多个结构域序列，同时保持蛋白表达基本元件、剩余序列不变。
• 精准删除的片段可大可小，单一外显子内片段删除或不同外显子之间片段删除均可。
• 重要的是，这种方法不同于常规的异位表达( ectopic expression)，不会影响目标基因启动子和其余未删除序列的转录。

脊髓型肌萎缩症（SMA）是一种严重的遗传性神经肌肉疾病，SMA患者携带了不同的SMN1突变，不能产生足够的SMN蛋白而致病。他们都有SMN2基因，由SMN2基因产生的SMN蛋白或可以弥补由SMN1基因突变引起的蛋白质缺乏。但SMN2基因的外显子7的第6位核苷酸出现C>T点突变，使得转录后的SMN2缺失第7个外显子，导致表达的SMN蛋白被截短并迅速降解。

构建小鼠Smn1点突变（C>T）模型可以为SMA药物探索提供有利的工具。

测序比对结果表明：纯合小鼠Smn1 基因的7号外显子第六个碱基点突变（C>T）成功。

Rest/Nrsf是一种重要的锌指蛋白转录负调控因子，在神经细胞中，泛素依赖的蛋白酶复合体介导Rest/Nrsf翻译后的降解，其中涉及到一种磷酸化依赖的E3连接酶-SCFβ-TRCP。目前，研究确定了Rest/Nrsf上的两个可能的磷酸化区域，每个区域包含两个或三个磷酸化残基。

为了使泛素依赖的降解途径失效，利用TALEN介导的多碱基突变技术，同时完成以下两项突变：

1. 在小鼠基因组中突变了五个可能的磷酸化位点；
2. 在突变区域附近引入一个同义突变，形成BamHI酶切位点，方便后续基因型鉴定。

Rest/Nrsf 由三个主要结构域组成：N端抑制结构域、DNA结合结构域和C端抑制结构域。

为了研究单个结构域的功能，我们精准删除了N端抑制结构域（92个氨基酸），从而产生了仅表达完整 DNA 结合结构域和完整C端抑制结构域的 Rest/Nrsf 的突变小鼠模型，为探索动物中N端和C端抑制结构域的不同生理功能提供了宝贵的工具。