基因敲除（KO）

全身性基因敲除或完全基因敲除，就是业内常说的KO（Knockout），是指在小鼠所有组织细胞中，将目的基因的某些指定外显子或功能结构域、甚至该基因所有外显子敲除掉，导致目的基因的表达缺失。

技术原理：

CRISPR/Cas系统是原核生物体内的一种适应性免疫防御系统，抵御外界环境中的噬菌体和外源DNA的侵袭。CRISPR/Cas9介导的基因敲除是指在sgRNA通过与Cas9蛋白相结合，形成核糖体蛋白复合物，指引Cas9蛋白特异性切割目标基因，造成DNA双链断裂（DNA double-strand break，DSB）。在不同类型的基因组损伤中，DNA双链断裂是一种常见且高度有害的损伤形式，非同源末端连接修复（non-homologous end-joining, NHEJ）是细胞内DSB迅速、高效的修复方式之一，无需引入模板，直接将两个DNA末端拼接，可能引起一些碱基缺失或插入基缺失或插入（indel  mutation），也可能导致基因组大片段敲除。当indel发生在编码区或剪接位点处，可能会导致蛋白质结构和功能的改变，从而影响生物体的性状，如编码区的indel会引起移码突变，即插入或缺失的碱基串的长度为3的非整数倍，可能导致整个阅读框的改变。

基因敲除（KO）包括：

• 移码突变-单gRNA位点
• 基因片段敲除（最大可敲除20 kb）-双gRNA位点

案例1、移码突变-Gene A

PCR-琼脂糖凝胶电泳图：                                                                        

Sanger测序结果：

结果：凝胶电泳图谱无法判断阳性结果，通过进一步测序比对可得到4个移码突变的KO结果。

案例2、基因组片段敲除-Gene B

PCR-琼脂糖凝胶电泳图（部分结果）：

部分阳性样本测序后比对结果：

结果：通过凝胶电泳图可知：部分样品被成功敲除目标片段，测序比对进一步证明：目标片段敲除成功。