四环素诱导目的基因沉默模型

简介

小发卡或短发卡RNA（a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA）是指一段具有紧密发卡环的RNA序列，常被用于RNA干扰、沉默靶基因的表达。将shRNA表达元件引入多顺反子荧光报告基因元件，与创新性四环素诱导表达系统和ES细胞打靶技术结合，能够在特定的组织、细胞及其不同发育阶段实现对内源基因的特异性沉默，提供给研究者一个精确且多功能的工具来研究基因沉默。

技术原理

吉玛新开发的以miR30和shRNA为基础的目的基因沉默模型：

1. shRNA表达元件作为目的基因的一部分被构建在多基因组合的表达框中，通过调控shRNA表达来达到基因沉默的目的：shRNA表达后被内源性miRNA加工处理，形成功能性的shRNA分子，这些成熟的shRNA有效地靶向、降解感兴趣的内源基因。

2. 利用四环素响应启动子元件来调控shRNA表达：添加Dox， shRNA表达；停止Dox供应，shRNA不表达。

3. 荧光蛋白（tdTomato）基因同时被构建在shRNA相关表达框中，跟随shRNA特异性表达，更直观地展示阳性结果。

4. 通过ES细胞打靶技术获得F0代嵌合鼠，进一步繁育后获得含遗传信息的后代小鼠。

与常用的慢病毒表达系统相比，四环素诱导基因沉默模型具有以下优势：

• 转基因的整合位点是可预测和可控的，操纵更精确；
• 通过与不同的Cre品系杂交，可以实现shRNA组织特异性表达；
• Dox在任何发育阶段添加均可诱导基因沉默，增强了模型的灵活性；
• 转基因表达是可逆的，不再添加DOX，基因沉默可以被关闭。

总的来说，独特的可诱导性和可逆性的沉默系统可在人为控制下，实现小鼠特定组织中特异性、可逆的内源基因沉默。

上皮细胞转化序列2（Ect2）是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），可催化GDP与GTP的交换，在细胞极性、纺锤体组装、细胞分裂等多种信号通路中充当分子开关。

结果：表达Ect2 shRNA导致小鼠ES细胞中的多倍体出现，并延迟小鼠胚胎的发育。