公司产品

siRNA转染试剂

GP-transfect-Mate是吉玛最新推出的新一代RNA高效转染试剂,可应用于RNA的转染实验。

产品描述

RNA干扰技术已经成为研究基因功能的有力工具。任何一个RNA实验的成功都有赖于:

1. 高质量的siRNA(或shRNA表达载体) 

2. 有效的转染方法

目前哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
阳离子脂质体转染试剂的选择对于利用siRNA介导的基因沉默实验来说同样是至关重要的。没有高效的转染,就不能有效的引发相应的细胞响应,会直接影响同一siRNA的抑制效果。只有将siRNA高效转染哺乳动物细胞,才能更真实的检测siRNA干扰基因表达的效果。
如何选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。转染试剂推荐使用GenePharma的转染试剂—GP-transfect-Mate


GenePharma的转染试剂

RNAi-Mate适用于核酸的体内和体外操作,可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,也可应用于DNA/siRNA的共转染操作。现有的商用siRNA转染试剂已不能满足高通量siRNA转染试验的需求。因此GenePharma公司推出RNAi-Mate转染试剂,一种新的高效siRNA转染试剂。

siRNA-Mate 是吉玛推出RNA高效转染试剂,可应用于RNA的转染实验。siRNA-Mate加快了与细胞表面糖蛋白的结合,从而促进了细胞的内吞。siRNA-Mate独特的特点是在内吞时,以及激发内涵体肿胀和破裂时可以保护RNA。最终siRNA-Mate和RNA从内涵体中释放。这些特点降低了非靶细胞特异性作用,从而增强了高特异性的基因沉默。siRNA-Mate转染效率高,很低浓度的siRNA就可以产生很高的基因沉默效率,siRNA-Mate可转染细胞系广。另外,siRNA-Mate对比其他siRNA转染试剂,对细胞毒性极小,转染后细胞状态最好。siRNA-Mate还是即用型的siRNA转染试剂,并且此试剂不受血清和抗生素的影响,操作简单快速。

GP-transfect-Mate是吉玛基因最新推出的一种高效能高分子聚合物转染试剂,应用于多种细胞的DNA质粒以及siRNA、miRNA oligo的体外转染实验。基于该聚合物结构分布一致性高,具有能够快速、均一性携带RNA或DNA等核酸物质复合能力,故可实观良好的重复性、均一性、低毒性的转染效果。与其它转染试剂比较,GP-transfect-Mace转染效率高、细胞存活率高、毒性小。可广泛用于瞬时和相对稳定转染,有助于蛋白表达和基因功能的研究。


应用领域:

1、贴壁细胞和悬浮细胞转染。
2、部分原代细胞和转化细胞株的基因转染 。
3、DNA转染;DNA和siRNA的共转染。
4、siRNA高通量转染试验。
5、核酸(siRNA、DNA、RNA)的体内导入试验。

特点:

1、不必更换培养基,操作简便易行,重复性好可在半小时内完成操作。
2、介导siRNA高转染细胞和体内高效导入
3、在含血清培养基中也能表现高转染效率
4、可在室温下运输,在4℃下可长期保存
5、细胞毒性低
6、适用细胞广泛;即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染,操作格外简单方便。
7、专门用于转染,确保没有RNAse活性

目录号 产品名称 规格 价格 交货期限
G04001 RNAi-Mate转染试剂 0.1ml ¥150 2个工作日
G04002 siRNA-Mate转染试剂 0.1ml ¥150 2个工作日
G04003 siRNA-Mate转染试剂 1ml ¥1,500 2个工作日
G04008 GP-transfect-Mate 0.1ml ¥150 2个工作日
G04009 GP-transfect-Mate 1ml ¥1,500 2个工作日

*本产品仅限于科研用途,而不适用于临床诊断、治疗等其他特殊用途。


功能介绍与实验实例

产品介绍 

与其它转染试剂比较,GP-transfect-Mate转染效率高、细胞存活率高、毒性小。可广泛用于瞬时和稳定转染,也可以应用于蛋白表达和基因功能的研究。 
转染试剂保存在 4℃,有效期1年。

重要提示

细胞的状态:转染时贴壁细胞的密度以 50%左右为佳,而且转染时细胞应处在生长旺盛的对数生长期。细胞密度过高和细胞传代数过高会影响转染效果。


siRNA
的质量:使用高纯度的siRNA也是转染成功的关键。在转染前需确定siRNA的含量和纯度,实验过程中需要使用DEPC处理过的耗材和试剂,注意避免RNAse污染。

血清的影响:在制备 siRNA-mate/GP-transfect-Mate  和 siRNA 形成复合体过程中不能添加血清,血清会影响复合体形成,建议用OPTI-MEM 或其他无血清培养基(如 DMEM、RPMI-1640 等)稀释 siRNA 和转染试剂,以达到复合物形成的最佳效果。但是,在随后的转染过程中,血清的存在并不影响复合体的转染效果。使用GP-transfect-Mate 进行转染时,多数情况下,在完全培养基中进行转染,并且转染后不更换培养基有助于获得更高的转染效率和更低的细胞毒性。

转染试剂的用量:对于一定量的siRNA建议尝试按照推荐剂量的转染试剂进行优化,以确定最佳的转染效率。

GP-transfect-Mate 案例

NA oligo

CAFs


A375


DNA质粒载体

NE-4C


MGC803


使用方法

转染的一般性指导

siRNA浓度和用量的一般换算:1OD≈33ug≈2.5nmol  1OD125ul的水,得到20uM的浓度。1ul就是20pmol,在1ml细胞培养液中加1ul20pmol),那终浓度就是20pmol/ml=20nM。加2ul就是40nM,以此类推。如果按ug计算,1OD125ug水溶解后,质量浓度为 33ug/125ul=0.264ug/ul。

siRNA影响基因阻断水平 (Gene Knockdown Level)的因素:
1、转染效率
2、目的基因转录效率
3、蛋白质稳定性
4、siRNA序列的有效性
5、所选择哺乳动物细胞系的生长特征

使用GP-transfect-Mate  转染RNA Oligo进入哺乳动物细胞时,遵从以下一般性指导:

为了获得最佳基因阻断结果,每一种细胞系转染siRNA或miRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系,推荐尝试使用几个 转染试剂-Mate的浓度,并在1-100nM范围内改变siRNA或miRNA的浓度,以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的siRNA或miRNA可能具有细胞系依赖性。

推荐在50%z左右细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。 GP-transfect-Mate 极低的细胞毒性可以方便研究者根据目的细胞生长特性,靶基因的表达特性,选择适合条件进行转染。

通过合适的FAM-NC、阳性对照优化转染和检测条件。可以使用吉玛荧光标记的阴性对照序列(根据目的RNA oligo类型,请选择对应的对照。Cat. No. A07001, B04004, B04005, B04006)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件,推荐在每一次实验都包括荧光标记的阴性对照序列,作为转染效率的指示剂。对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照(Cat. No. A08005, A08008)。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

避免RNA酶污染。微量的RNA酶将导致siRNA/miRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品。因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。尤其直接接触Oligo原液的枪头、Tube,请务必保证RNase free。我们推荐商业化的RNase free的枪头及Tubes。

健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性。通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。

目的检测时间点。细胞转染后,不同细胞和RNA效率存在差异。一般来说,在mRNA水平观察RNAi效果的最佳时间是转染后24-48小时,在蛋白水平观察RNAi效果的最佳时间是转染后48-72小时。siRNA干扰是抛物线形的,不同基因的半衰期是不同的,多做几个时间点有利于siRNA干扰效果的测定。

转染操作注意:将siRNA/miRNA oligo—GP-transfect-Mate复合物逐滴均匀滴加到每一个包含细胞和培养基的孔中。均匀滴加后可以轻轻地前后摇动培养板混合均匀。



需要准备的材料

开始实验前准备下列试剂:

目的哺乳动物细胞系(使用传代数低的细胞;转染前确信细胞健康和超过90%的存活率)

目的siRNA或者miRNA Oligo(吉玛推荐溶解至20μM储液)

 GP-transfect-Mate  (使用前贮存在+4℃)

培养基(使用前37℃预热)

合适的细胞培养板及其它

GP-transfect-Mate 操作流程(24 孔板)

24 孔板为例,若要检测基因沉默或者过表达效果,推荐最低RNA oligo终浓度为50nM ,(DNA为0.5~1.5μg);遵循以下操作方法可以高效地将RNA  oligo或者DNA转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。但是对某些特殊的细胞系和培养条件,或特殊应用等,也需要单独特别优化,请参考表 1、表2。

1. 细胞铺板

转染时细胞密度:一般来说,当细胞密度达到60%80%时进行转染可以取得较高的转染效率(参见表1)。然而,不同细胞的最适转染密度都不尽相同,因此在初次转染某种细胞时,可以通过预实验先确认该细胞最佳的转染密度。

2. 转染复合物的制备

1)将 GP-transfect-Mate转染试剂放置于室温中,使用前轻轻混匀。

2)在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM,并添加适量的转染试剂(参见表2),用移液器轻轻混匀,室温静置5 min

3)同时在另一1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM,并添加适量的RNA oligo/DNA (参见表2),用移液器轻轻混匀,室温静置5 min

4)将GP-transfect-Mate-培养基混合物滴加至RNA oligo/DNA-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀,室温静置15-20 min 后,立即转染。

注:复合物尽量在60 min内使用,并且GP-transfect-Mate-培养基混合物和RNA oligo/DNA-培养基混合物的混合次序非常重要,切勿颠倒。

3. 转染过程

1)趁静置时,给 24 孔板换液,每孔换上 0.4ml 预热的新鲜培养基。

2)将 100 µl 转染混合物加入孔中,终体系为500 µl。加完后将板轻轻晃动以使复合物均匀分布。

337℃静置培养细胞,4-6h换成完全培养基。24-72 h检测mRNA表达,48-96 h检测蛋白表达。

适用范围

293T, A549, Beas-2B,HeLa,ECA-109,Raw264.7,A375,CAFs,HCT116,HT29,LMH,NE-4C,MGC803,PC-3, PC-12MCF-7,C6等细胞。

 1: 贴壁细胞或悬浮细胞接种数量、培养基体积

培养器皿

每孔表面积(cm2

每孔培养基的体积(ml

贴壁细胞转染前一天接种密度

悬浮细胞转染当天接种密度

96 孔板

0.3

0.1

5 000±2 500

2-5×104

24 孔板

2

0.5

25000±10 000

1-2.5×105

12 孔板

4

1

50000±20 000

2-5×105

孔板

10

2

150000±50 000

0.4-1×106

60mm

20

4

400000±100 000

1-2.5×106

100mm

60

10

1*106±250 000

2-5×106

注:贴壁细胞培养密度取决于培养器皿的表面积,而悬浮细胞则由培养基的体积决定。


 2 不同培养板转染DNA/RNA  oligo的推荐转染条件

培养器皿

Growth

Medium

Opti-MEM/ Serum-free Mediumfor complex

DNA 转染

RNA转染

DNA/μg

转染试剂/μl

RNA/pmol

转染试剂/μl

96 孔板

100 μl

2×10μl

0.2

0.4-1

20

0.5-1

24 孔板

500 μl

2×50μl

0.6

1.2-3

40

1-3

12 孔板

1ml

2×100μl

1.5

3-6

80

3-5

孔板

2 ml

2×200 μl

3

6-12.5

150

5-8

60mm

5ml

2×500 μl

6-10

12-20

300

10-20

100mm

10 ml

2×1ml

15-30

30-60

500

25-35

注:GP-transfect-Mate转染试剂的用量在此范围内进行优化。



siRNA-MateTM转染步骤(以24孔板为例) 


使用siRNA-MateTM转染siRNA或miRNA Oligo进入哺乳动物细胞时,使用下述步骤。参阅表1-表3,确定加入不同组织培养方式的试剂量以及体积。吉玛推荐以5nM siRNA或miRNA Oligo终浓度,及表1中推荐的siRNA-MateTM的量作为优化的起始点,客户可针对目的细胞系和siRNA或miRNA Oligo(推荐终浓度范围1-100nM)进行优化。

转染前一天,根据表1推荐的细胞数量,提前一天将细胞接种在24孔板中,以转染时细胞的汇合度 (Confluence) 在30-50%为宜。

每一个转染样品按照如下的方法准备siRNA/miRNA oligo—siRNA-Mate复合物:

转染前,取siRNA/miRNA oligo储液适量稀释至1uM(吉玛推荐的储液是20uM,取1ul加入19ul RNase free water,稀释至1uM)。取3ul 1uM的siRNA/miRNA oligo溶液加入到100 µl Opti-MEM或无血清DMEM,无血清1640。轻轻混匀,室温放置5min。

孵育5min后,取2ul siRNA-MateTM加入到a.中准备好的培养基稀释的siRNA/miRNA oligo,加入后立即充分混匀(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上),轻微离心后,室温放置10min(请保证足够时间静置,且孵育时间不超过1h)。以便允许siRNA/miRNA oligo—siRNA-Mate复合物的形成。

在复合物孵育的10min内,从细胞培养板中移除原有的培养基。每孔加入500ul的完全培养基(可含10%血清和抗生素)。siRNA-MateTM不受血清和抗生素的影响。

将siRNA/miRNA oligo—siRNA-Mate复合物逐滴滴加到每一个包含细胞和培养基的孔中。轻轻地前后摇动培养板混合均匀。使用siRNA-MateTM转染中无需去除复合物或者改换培养基,若目的细胞本身对于转染操作较为敏感(如原代细胞),我们建议可在转染后4-6小时改换完全培养基,并不会损失转染的活性。

37℃,CO2培养箱孵育24-96小时,直到适合进行目的基因分析。我们建议做目的RNA检测可在24-48h收集细胞检测,目的蛋白检测可在48-72h收集检测。


表1 提前1天种植细胞数量和培养基体积

培养容器 转染前天接种细胞数量 每孔表面积(cm2) 每孔培养基总体积(ml)
96-well> 7 500 ± 2 500> 0.3> 0.2 ml>
48-well> 15 000 ± 5 000> 1> 0.5 ml>
24-well> 25 000 ± 10 000> 1.9> 1 ml>
12-well> 50 000 ± 20 000> 3.8> 2 ml>
6-well/ 35 mm> 150 000 ± 50 000> 9.4> 4 ml>
60 mm/ T25 flask> 400 000 ± 100 000> 28> 8 ml>
100 mm/ T75 flask> 1 000 000 ± 250 000> 78.5> 15 ml>


表2 siRNA-MateTM推荐用量(24孔板)

siRNA/miRNA终浓度$3C4FSTRONG>

siRNA-MateTM用量/24

> 10 nM 3 ± 1 ul
≤10 nM 1 to 2 µl

表3 不同细胞培养容器转染推荐用量

培养容器 表面积相对于24孔比率 RNA用量(pmol siRNA-MateTM用量 RNAsiRNA-Mate复合物 每孔培养基 总体积 RNA终浓度*
96-well 0.2 0.85 1 ± 0.5 µl 50 µl 125 µl 175 µl 5nM
24-well 1 3 2 ± 1 µl 100 µl 500 µl 600 µl 5nM
12-well 2 6 4 ± 2 µl 200 µl 1 ml 1.2 ml 5nM
6-well/ 35 mm 5 11 8 ± 2 µl 200 µl 2ml 2.2 ml 5nM
60 mm/ T25 flask 10 22 15 ± 5 µl 400 µl 4ml 4.4 ml 5nM
100 mm/ T75 flask 15 52.5 40 ± 10 µl 500 µl 10ml 10.5 ml 5nM

建议根据您的实验体系做RNA终浓度的优化。
 
其它事项

RNA有效浓度和转染试剂量的优化。为得到更好的结果,优化方案每孔RNA量可以从1nM-100nM优化。

细胞密度。不同的细胞密度可能会极大影响转染效率和细胞毒性,为求最佳转染效果,建议转染时的细胞密度从30%到50%进行不同细胞梯度转染,确定最佳转染数量。

稀释用液的选择。在配置RNA-siRNA-Mate复合物时,必须采用无血清培养基!建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或无血清1640。

培养时间。应用本转染试剂后,由于不同细胞和RNA效率的差异,一般来说,在mRNA水平观察RNAi效果的最佳时间是转染后24-48小时,在蛋白水平观察RNAi效果的最佳时间是转染后48-72小时。

细胞生长的培养基。细胞生长的培养基没有特殊要求,可以采用含血清培养基或加入抗生素。


产品说明书

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1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具 

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