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RNAi对照

吉玛可提供与目的基因序列无同源性的通用阴性对照和将选中的siRNA序列打乱(scrambled)的阴性对照

产品描述


吉玛可以提供阴性和阳性siRNA对照

阴性对照: 通用对照(NC),固定序列,与人,大鼠,小鼠转录组比对无同源性。

                 定制序列对照(scramble NC): 根据客户提供siRNA序列打乱,与转录组比对无同源性。

阳性对照(部分基因):GAPDH,b-actin,GFP等


A. 阴性对照

吉玛可提供与目的基因序列无同源性的通用阴性对照和将选中的siRNA序列打乱(scrambled)的阴性对照 1. siRNA实验应该有阴性对照;
2. 通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照;
3. Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性;
4. 阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因没有同源性。


   
B. 荧光标记(FAM)的阴性对照
吉玛可提供与目的基因序列无同源性的FAM标记的通用阴性对照 1. 通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照;
2. 通过标记荧光,可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况;
3. 可用于优化转染条件和评价转染效率;
4. 具备很好的pH耐受性,在活细胞中更稳定。

目录号

产品名称

规格

纯化方式

价格

交货期限

A06001

阴性对照siRNA

1 OD

HPLC

¥120

2个工作日

A07001

FAM标记阴性对照siRNA

1 OD

HPLC

¥150

2个工作日


C. 阳性对照

吉玛公司可提供的常用的siRNA阳性对照

阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说,当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时,您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的

1. GFP-274

2. Luciferase GL2

3. GAPDHhuman/mouse/rat

4. β-actin (human/mouse/rat

5. P53

6. lamin A/C


目录号

产品名称

规格

纯化方式

价格

交货期限

A08001

阳性对照siRNA, LaminA/C

1 OD

HPLC

¥120

4个工作日

A08002

阳性对照siRNA, GFP274

1 OD

HPLC

¥120

2个工作日

A08003

阳性对照siRNA, Luciferase GL2

1 OD

HPLC

¥120

4个工作日

A08004

阳性对照siRNA, MAPK1

1 OD

HPLC

¥120

4个工作日

A08005

阳性对照siRNA, Beta-Actin

1 OD

HPLC

¥120

2个工作日

A08006

阳性对照siRNA, Vimentin

1 OD

HPLC

¥120

4个工作日

A08007

阳性对照siRNA, P53

1 OD

HPLC

¥120

2个工作日

A08008

阳性对照siRNA, GAPDH

1 OD

HPLC

¥120

2个工作日

A08009

阳性对照siRNA, Cyclophilin B

1 OD

HPLC

¥120

4个工作日


D. 转染试剂对照

对于一个完善的对照系统,转染试剂对照(Mock transfection )是不可缺的。转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响。

我们推荐使用我们公司最新的GenePharma转染试剂 。(见转染试剂)

目录号

产品名称

规格

价格

交货期限

G04001

RNAi-Mate转染试剂

0.1ml

150

2个工作日

G04002

siRNA-Mate转染试剂

0.1ml

150

2个工作日

G04003

siRNA-Mate转染试剂

1ml

1,500

2个工作日

G04008

GP-transfect-Mate

0.1ml

150

2个工作日

G04009

GP-transfect-Mate

1ml

1,500

2个工作日

E. 避免脱靶效应对照

对于RNAi研究来说,在哺乳动物中,脱靶效应是一个十分关注的问题。有大量的报道,一个siRNA影响多个基因的表达。因此,大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验,然后分析各自对基因表达效果的影响。理想的结果是针对不同区域的siRNA对同一个靶基因产生相似的干扰效果。吉玛公司的技术人员为您针对同一个靶基因设计多对siRNA oligos,为您解决脱靶效应的难题。

注: NC序列是大量文献引用的一段序列,和所有的哺乳动物都没有同源性,适用于大鼠、小鼠、人等不同基因的研究。

功能介绍与实验实例

FAM-siRNA 对照产品的溶解及保存

1.1 由于OligoRNA很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开离心管前先离心,然后再慢慢打开管盖,溶解时加适量DEPC水后盖上管盖,振荡溶解。

1.2  1OD≈33ug≈2.5nmol为了得到20uM的浓度,应该使用125ul附送的DEPC水去重悬1OD的siRNA,溶解后为20uM的样品。

1.3 贮存和稳定性:-20℃,荧光标记产品需要避光保存。液体(贮存浓度为20μM)溶解后分装,避免反复冻融,3个月内用完;-20或者-80保存下siRNA oligo 干粉的稳定性可达到6个月,使用的管子、枪头要无酶处理。

荧光标记的siRNA

转染效率的高低可以通过荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)实现。

FAM-siRNA 转染细胞后,可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测,确定是否有效转染和优化转染条件。FAM-siRNA 还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。                                            

                                                  图1. FAM-NC转染细胞后的荧光

        

                                                              图2. CY3-NC转染细胞后的荧光图     

       

                                                      图3. 以B为校准hACTB为内参hGAPDH基因表达水平

使用方法

A.siRNA转染的方法
哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面:转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时的细胞密度、转染时的操作顺序、细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间


GP-transfect-Mate 操作流程(24 孔板)

24 孔板为例,若要检测基因沉默或者过表达效果,推荐最低RNA oligo终浓度为50nM

DNA0.5~1.5μg);遵循以下操作方法可以高效地将RNA  oligo或者DNA转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。但是对某些特殊的细胞系和培养条件,或特殊应用等,也需要单独特别优化,请参考表 1、表2

1.       细胞铺板

转染时细胞密度:一般来说,当细胞密度达到60%80%时进行转染可以取得较高的转染效率(参见表1)。然而,不同细胞的最适转染密度都不尽相同,因此在初次转染某种细胞时,可以通过预实验先确认该细胞最佳的转染密度。

2. 转染复合物的制备

1)将 GP-transfect-Mate转染试剂放置于室温中,使用前轻轻混匀。

2)在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM,并添加适量的转染试剂(参见表2),用移液器轻轻混匀,室温静置5 min

3)同时在另一1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM,并添加适量的RNA oligo/DNA (参见表2),用移液器轻轻混匀,室温静置5 min

4)将GP-transfect-Mate-培养基混合物滴加至RNA oligo/DNA-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀,室温静置15-20 min 后,立即转染。

注:复合物尽量在60 min内使用,并且GP-transfect-Mate-培养基混合物和RNA oligo/DNA-培养基混合物的混合次序非常重要,切勿颠倒。

3. 转染过程

1)趁静置时,给 24 孔板换液,每孔换上 0.4ml 预热的新鲜培养基。

2)将 100 µl 转染混合物加入孔中,终体系为500 µl。加完后将板轻轻晃动以使复合物均匀分布。

337℃静置培养细胞,4-6h换成完全培养基。24-72 h检测mRNA表达,48-96 h检测蛋白表达。


适用范围

293T, A549, Beas-2B,HeLa,ECA-109,Raw264.7,A375,CAFs,HCT116,HT29,LMH,NE-4C,MGC803,PC-3, PC-12MCF-7,C6等细胞。

 1: 贴壁细胞或悬浮细胞接种数量、培养基体积

培养器皿

每孔表面积(cm2

每孔培养基的体积(ml

贴壁细胞转染前一天接种密度

悬浮细胞转染当天接种密度

96 孔板

0.3

0.1

5 000±2 500

2-5×104

24 孔板

2

0.5

25000±10 000

1-2.5×105

12 孔板

4

1

50000±20 000

2-5×105

孔板

10

2

150000±50 000

0.4-1×106

60mm

20

4

400000±100 000

1-2.5×106

100mm

60

10

1*106±250 000

2-5×106

注:贴壁细胞培养密度取决于培养器皿的表面积,而悬浮细胞则由培养基的体积决定。

 2 不同培养板转染DNA/RNA  oligo的推荐转染条件

培养器皿

Growth

Medium

Opti-MEM/ Serum-free Mediumfor complex

DNA 转染

RNA转染

DNA/μg

转染试剂/μl

RNA/pmol

转染试剂/μl

96 孔板

100 μl

2×10μl

0.2

0.4-1

20

0.5-1

24 孔板

500 μl

2×50μl

0.6

1.2-3

40

1-3

12 孔板

1ml

2×100μl

1.5

3-6

80

3-5

孔板

2 ml

2×200 μl

3

6-12.5

150

5-8

60mm

5ml

2×500 μl

6-10

12-20

300

10-20

100mm

10 ml

2×1ml

15-30

30-60

500

25-35

注:GP-transfect-Mate转染试剂的用量在此范围内进行优化。




B.Lipofectamin2000 转染试剂

选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作,可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,也可应

用于DNA/siRNA的共转染操作;是一种新型的高效siRNA转染试剂。


Lipofectamin2000的应用领域:

1、原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
2、siRNA高通量转染试验
3、DNA转染;DNA和siRNA的共转染
4、核酸(siRNA、DNA、RNA)的体内导入试验
5、贴壁细胞和悬浮细胞转染


Lipofectamin2000 的特点: 

1、不必更换培养基,操作简便易行,可在半小时内完成操作
2、在含血清培养基中也能表现高转染效率
3、细胞毒性低;适用细胞广泛
4、即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染
5、基于脂质的转染试剂,确保没有RNAse活性
6、可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入


C. Lipofectamin2000适用的细胞类型

Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如:HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。


D.转染前细胞培养

在细胞板上培养细胞时,应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。


E.合适的lipofectamin2000用量

合适的siRNA(DNA):lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响;我们推荐的DNA:lipofetamin2000为1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000为1:0.01-1:0.1(pmol:ul)一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。



F.贴壁细胞转染程序

选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。

1、转染前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上, 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培养基)细胞培养基。
2、选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
3、在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;
4、混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μllipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;

5、将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。
6、将100μl siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。
7、 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。  


G.悬浮细胞转染程序

1、转染的当天,收集细胞离心,用含FBS的培养基重悬。
2、在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;
3、混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μl lipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;
4、将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。
5、再加入400μL细胞悬浮液(细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间)。
6、细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。  



H.DNA和siRNA共转染细胞

1、在转染的前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上,0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。
2、选择用于初期接种的细胞密度,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
3、在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA,加入2μl lipofectamin试剂,充分混合,放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。
4、将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中,轻轻混匀。
5、细胞在37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它步骤。


I.siRNA体内导入方法

1、适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中,轻轻混匀,因为注射液体积有限,建议采用高浓度的siRNA或DNA,一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。
2、取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如,在1#管中加入0.5μL的DNA(1μg)和0.5μL的siRNA(5μg),在2#管中加入0.55μL的lipofectamin(24μg)和0.45μL不含RNA酶的无菌水中,将1#管中的溶液加入2#管中,在室温下温育30分钟,以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。
3、制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。

产品说明书

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