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CRISPR技术简介及运用

产品描述

CRISPR/Cas9技术简介

CRISPR/Cas系统是在大多数细菌(40%)和古细菌(90%)中发现的一种天然免疫系统,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR指的是规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)。 Cas(CRISPR-associated genes)为CRISPR相关基因。
当噬菌体感染细菌后,病毒DNA进入细菌细胞,细菌细胞表达Cas复合体对噬菌体DNA进行切割得到间隔序列,间隔序列在cas1 和cas2作用下插入到CRISPR最前端(如图Phase1)形成免疫。




当噬菌体再次感染细菌时,以较为简单的Type II型CRISPR/Cas系统为例,细菌表达 tracrRNA、前体crRNA及Cas9蛋白(RNA引导的核酸内切酶),tracrRNA和crRNA由于部分序列互补而结合,Cas9与tracrRNA和crRNA形成复合体并由Cas9加工成为成熟crRNA-tracrRNA Cas9复合体,成熟复合体由间隔序列引导识别病毒靶序列,并切断病毒DNA(如图Phase2)。复合体只能识别与间隔序列一致并且3'端含PAM(protospacer adjacent motif原间隔序列邻近模块序列,如不同来源CRISPR/Cas9系统有不同序列,如链球菌CRISPR/Cas9系统PAM序列未NGG)的靶序列,即PAM原间隔序列邻近模块序列,这是CRISPR/Cas9不剪切自身间隔序列的原因。



2013年1月,在Science上发表了两篇以链球菌CRISPR/Cas9系统为基础对哺乳动物细胞进行基因组编辑新方法,利用一条gRNA(guid RNA)模拟成熟的 crRNA-tracrRNA复合体与Cas9共同作用切割靶基因组(如下图),由此揭开了该技术的运用高潮。





到目前为止CRISPR/Cas已经运用到了各种细胞以及大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、线虫、果蝇、蚕、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猪、羊等,从最低等的微生物到哺乳动物的基因敲除修饰或突变,另外一方面其强大的基因组编辑能力已经用于生物治疗,如 HIV HBV等RNA病毒引起的疾病治疗研究,单基因或多基因遗传病治疗研究,癌症治疗研究等方面。


CRISPR/Cas相比其它基因组编辑技术,如锌指核酸酶(ZFNs)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs),操作更简单,同时更容易针对同一细胞中的多个基因位点进行编辑,该系统可成为替代目前基因组工程方法的一种更安全,毒性更低的新方法。


CRISPR技术运用:

CRISPR技术可运用于各种细胞,各个物种基因敲除,敲入,修饰或突变等,另外利用失去核酸酶活的Defect Cas9与不同功能结构域融合,可以实现基因干扰,激活,染色体染色,特定DNA纯化等特殊功能。

1、基因敲除(Gene Knockout)
利用双剪切或同源重组直接移除miRNA/lncRNA基因序列或蛋白编码基因的关键外显子,使其发生移码突变,从而使靶基因功能完全丢失。

2、基因敲入(Gene Knockin)
通过基因断裂诱导的同源重组,选择性将靶基因敲入Rosa26位点(人细胞选择敲入类似基因THUMPD3-AS1),靶基因可以是小RNA,lncRNA或蛋白编码基因,条件性敲入还可实现基因表达的实时控制。

3、基因修饰/突变(Gene Modification/Mutation)
通过基因断裂诱导的同源重组,可以在原基因中插入报告基因或标签序列,实现目的基因的检测、追踪和功能研究;也可以改变原有基因的编码序列来研究其对基因功能的影响。

4、基因编辑以外的运用(Other Applications)
利用dCas9(Defect Cas9)与特殊功能蛋白结构域的融合表达,还可使其发挥特殊功能。与转录激活或转录抑制蛋白结构域的融合表达,还可实现特定基因的过表达或干扰;与荧光蛋白的融合表达,可用于染色体染色;与表面抗原的融合,可用于纯化特定基因组片段等。


功能介绍与实验实例

实验数据

使用方法

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应用实例

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