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CRISPR技术简介及运用
CRISPR/Cas9技术简介
CRISPR/Cas系统是在大多数细菌（40%）和古细菌（90%）中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR指的是规律成簇的间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。 Cas（CRISPR-associated genes）为CRISPR相关基因。
当噬菌体感染细菌后，病毒DNA进入细菌细胞，细菌细胞表达Cas复合体对噬菌体DNA进行切割得到间隔序列，间隔序列在cas1 和cas2作用下插入到CRISPR最前端（如图Phase1）形成免疫。
当噬菌体再次感染细菌时，以较为简单的Type II型CRISPR/Cas系统为例，细菌表达 tracrRNA、前体crRNA及Cas9蛋白（RNA引导的核酸内切酶），tracrRNA和crRNA由于部分序列互补而结合，Cas9与tracrRNA和crRNA形成复合体并由Cas9加工成为成熟crRNA-tracrRNA Cas9复合体，成熟复合体由间隔序列引导识别病毒靶序列，并切断病毒DNA（如图Phase2）。复合体只能识别与间隔序列一致并且3'端含PAM（protospacer adjacent motif原间隔序列邻近模块序列，如不同来源CRISPR/Cas9系统有不同序列，如链球菌CRISPR/Cas9系统PAM序列未NGG）的靶序列，即PAM原间隔序列邻近模块序列，这是CRISPR/Cas9不剪切自身间隔序列的原因。
2013年1月，在Science上发表了两篇以链球菌CRISPR/Cas9系统为基础对哺乳动物细胞进行基因组编辑新方法，利用一条gRNA（guid RNA）模拟成熟的 crRNA-tracrRNA复合体与Cas9共同作用切割靶基因组（如下图），由此揭开了该技术的运用高潮。
到目前为止CRISPR/Cas已经运用到了各种细胞以及大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、线虫、果蝇、蚕、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猪、羊等，从最低等的微生物到哺乳动物的基因敲除修饰或突变，另外一方面其强大的基因组编辑能力已经用于生物治疗，如 HIV HBV等RNA病毒引起的疾病治疗研究，单基因或多基因遗传病治疗研究，癌症治疗研究等方面。
CRISPR/Cas相比其它基因组编辑技术，如锌指核酸酶（ZFNs）或转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），操作更简单，同时更容易针对同一细胞中的多个基因位点进行编辑，该系统可成为替代目前基因组工程方法的一种更安全，毒性更低的新方法。
CRISPR技术运用：
CRISPR技术可运用于各种细胞，各个物种基因敲除，敲入，修饰或突变等，另外利用失去核酸酶活的Defect Cas9与不同功能结构域融合，可以实现基因干扰，激活，染色体染色，特定DNA纯化等特殊功能。
1、基因敲除（Gene Knockout）
利用双剪切或同源重组直接移除miRNA/lncRNA基因序列或蛋白编码基因的关键外显子，使其发生移码突变，从而使靶基因功能完全丢失。
2、基因敲入（Gene Knockin）
通过基因断裂诱导的同源重组，选择性将靶基因敲入Rosa26位点（人细胞选择敲入类似基因THUMPD3-AS1），靶基因可以是小RNA，lncRNA或蛋白编码基因，条件性敲入还可实现基因表达的实时控制。
3、基因修饰/突变（Gene Modification/Mutation）
通过基因断裂诱导的同源重组，可以在原基因中插入报告基因或标签序列，实现目的基因的检测、追踪和功能研究；也可以改变原有基因的编码序列来研究其对基因功能的影响。
4、基因编辑以外的运用（Other Applications）
利用dCas9（Defect Cas9）与特殊功能蛋白结构域的融合表达，还可使其发挥特殊功能。与转录激活或转录抑制蛋白结构域的融合表达，还可实现特定基因的过表达或干扰；与荧光蛋白的融合表达，可用于染色体染色；与表面抗原的融合，可用于纯化特定基因组片段等。
实验数据
使用方法
应用实例
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