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公司产品
shRNA质粒载体
shRNA表达载体带有抗生素标记，可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。对于一个已知有效的siRNA序列（例如，经过siRNA合成方法筛选获得的），需要维持较长时间的基因沉默时，推荐使用shRNA载体系统。
shRNA表达载体带有抗生素标记，可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。对于一个已知有效的siRNA序列（例如，经过siRNA合成方法筛选获得的），需要维持较长时间的基因沉默时，推荐使用shRNA载体系统。吉玛致力于提供最先进和最方便的shRNA相关工具，最近推出新一代shRNA表达质粒，一种高效即用型载体，该载体在细胞内可以持续产生shRNAs，从而达到持久抑制目标基因表达的目的。
吉玛 supersilencingTM shRNA表达载体系统
shRNA表达载体系统特点：
产生短发夹型RNA（shRNA）来完成RNA干扰
方法简单、经济实惠，只需合成DNA寡核苷酸克隆载体使用方便，带有筛选标记
克隆载体使用方便，带有筛选标记
shRNA质粒稳定，易于操作
GenePharma supersilencingTM shRNA表达载体特点：
1、克隆载体具有两种形式的克隆酶切位点BbsⅠ和 BamHⅠ。
BbsⅠ是特殊的限制性内切酶，产生非对称互补粘性末端，保证插入片断的方向正确，防止载体自体连接。
2、shRNA多种筛选标记可帮助建立稳定转染细胞系
Neo ：Neomycin耐受基因
Hygro ：Hygromycin B 耐受基因
GFP：GFP报告基因
RFP：RFP报告基因
报告基因GFP/RFP可以帮助评价转染效率和指示RNAi发生位点
本公司共可构建11种RNAi Vector，分别为pGPU6, pGPH1, pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro, pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo，pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo,pGPU6/mCherry/Puro。
其中pGPU6, pGPH1为无筛选标记RNAi载体；
pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro为含抗性筛选标记Neomycin和Hygromycin的RNAi载体；
pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo分别为含抗性筛选标记Neomycin同时可以表达GFP蛋白的RNAi载体；
pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo分别为含抗性筛选标记Neomycin同时可以表达RFP蛋白的RNAi载体。
11种RNAi Vector载体图谱如下：
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每套载体均包括线状或环状shRNA表达载体，并为您提供整体的解决方案。 |
| 套装组成 | 数量 |
| 针对目的基因的shRNA载体 | 4个 |
| 阳性对照shRNA载体 | 1个 |
| 阴性对照shRNA载体 | 1个 |
| 注：套装中所有质粒提供量为50ug | |
| 目录号 | 产品名称 | 规格 | 价格 | 交货期限 |
| C01001 | SuperSilencing™ shRNA质粒表达载体套装> | 1 套 | ￥2,600 | 2周 |
| 目录号 | 产品名称 | 规格 | 价格 | 交货期限 |
| C03001 | GAPDH SuperSilencing shRNA™ 质粒表达载体 | 50ug | ￥199 | 1周 |
| C03002 | Negative Control SuperSilencing shRNA™ 质粒表达载体 | 50ug | ￥199 | 1周 |
我们可以帮您将编码目标shRNA 的DNA插入质粒，并做序列正确性检测，您只需告诉我们靶基因序列或Gene ID号和希望插入载体的名称，我们来帮您构建。我们为您提供足够使用的纯化的编码您的目的shRNA的表达质粒。
| 目录号 | 产品名称 | 规格 | 价格 | 交货期限 |
| C02001 | ShRNA质粒表达载体 (pGPU6) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02002 | ShRNA质粒表达载体 (pGPH1) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02003 | ShRNA质粒表达载体 (pGPU6/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02004 | ShRNA质粒表达载体 (pGPH1/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02005 | ShRNA质粒表达载体 (pGPU6/Hygro) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02006 | ShRNA质粒表达载体 (pGPH1/Hygro) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02007 | ShRNA质粒表达载体 (pGPU6/GFP/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02008 | ShRNA质粒表达载体 (pGPH1/GFP/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02009 | ShRNA质粒表达载体 (pGPU6/RFP/Neo) | 50μg | ￥599 | 2周 |
| C02010 | ShRNA质粒表达载体 (pGPH1/RFP/Neo ) | 50μg | ￥599 | 2周 |
如果您选择吉玛公司的Validated SuperSilencing shRNATM 质粒表达载体，吉玛提供配套的阴性对照质粒，阴性对照质粒是RNA干扰试验所必须的，一个好的GAPDH阳性对照载体，可以让您试验体系更加稳定，也可以检测试验中可能出现的问题。
客户将siRNA片段克隆到目的表达载体后，需制备大量高纯度或无内毒素的质粒进行下一步实验，为此吉玛公司推出制备高纯度质粒的服务。
shRNA细胞转染实验实例
一、 细胞培养
人胚肾细胞293T，常规培养使用含10% FBS (Gibco)的DMEM培养基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine, 3.7 g/L NaHCO3, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin)中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、 GAPDH siRNA片段的设计与合成
人GAPDH的干扰序列信息见表1。实验所用shRNA的设计由吉玛公司（GenePharma, Shanghai）提供服务。
表1 GAPDH基因的靶点序列
| shRNA | Strand | sequence |
| GAPDH | target | |
| NC | 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGU -3 |
寡核苷酸的设计
shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5'端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。
Negative Control-S:
5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGT TTCAAGAGA ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTT G-3'
Negative Control- AS:
5'-GATC CAAAAAA TTCTCCGAACGTGTCACGT TCTCTTGAA ACGTGACACGTTCGGAGAAC-3'
pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体的构建
1. 按照如下体系进行载体的连接反应：
| Components | Volume (ul) |
| 10×T4 Ligation Buffer | 2 |
| pGPU6/GFP/Neo(Bbs I+BamH I) | 1 |
| shRNA template( 20nM) | 1 |
| T4 DNA ligase( 5 weissU/ul) | 1 |
| ddH2O | 15 |
| Total | 20 |
2. 22℃ 反应1hr, 将连接产物转化到感受态细胞中。
3. 每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50 ug/ml Kanamycin的LB培养集中。
4. 使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamH I, Pst I分别酶切鉴定。5. 阳性重组载体送去测序。
三、 shRNA质粒的转染
实验材料及试剂
DMEM培养基+10% FBS
D-Hank's Solution
Trypsin-EDTA Solution (0.25% Trypsin +0.53 mM EDTA, Hyclone)
Lipofectamin2000转染试剂（Invitrogen）
Opti-MEM I Reduced serum medium(Gibco)
无抗生素的DMEM培养基
12孔板 （Corning）
步骤
1. 293T细胞在10 cm培养皿中培养至80-90%融合时，接种12孔板。
2. 倾去培养液，用5 ml D-Hank's solution洗涤细胞两次。
3. 加入2 ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，37ºC放置3-5分钟。
4. 小心吸去胰酶溶液，在加入2 ml 含10% FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
5. 血球计数板计数，将细胞稀释至5×105细胞/ml。
6. 按2.5×105细胞/孔的浓度接种12孔板，混匀后于37ºC 5% CO2培养24小时。
7. 在1.5 ml EP管中加入100 μl Opti-MEM I，再加入2μg质粒，取另一1.5mlEP管，加入100μl Opti-MEM I，加入4μl Lipofectamin2000，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20~30分钟。
8. 吸去12孔板中的培养液，每孔加入800 μl无血清的DMEM培养液。
9. 将转染混合物逐滴加入12孔板中，混匀后，在培养箱中温育4-6小时。
10. 吸弃转染液，加入1ml含10% FBS的DMEM培养液。37ºC 5% CO2继续培养24-48小时。
11. 所得细胞用于RNA抽提并进行后续RT-PCR以及Western Blot检测。
实验结果与分析
细胞转染结果
以下为细胞转染质粒后48小时的荧光照片，两图为同一视野。转染效率在90%以上。
总RNA的质量检测
转染后24小时用Trizol法提取抽取细胞总RNA，所得RNA溶解于DEPC处理的ddH2O中。采用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整度，采用分光光度法测定RNA的浓度和纯度。实验中所得样品的OD260/OD280的值均在1.8-2.0范围之内，并根据OD260计算浓度，调整RNA的浓度为500 ng/μl；琼脂糖凝胶电泳结果（图2）表示，28S rRNA与18S rRNA的亮度比值约为2：1，说明实验中所抽提得到的总RNA质量较好，无降解，可以满足后续实验的要求。
转染后24小时细胞RNA样品1，GAPDH干扰组；2，NC；3，Mock；4，Blank
四、 Real-time PCR法检测RNA干扰效果
4.1 Homo-actin RNA Gene, GAPDH amplification Curves
Sample.M actin RNA Gene.GAPDH gene amplification plots.
Electrophoresis of GAPDH gene PCR Products:
Marker:50bp
五、 Western blot法检测RNA干扰效果
结果与分析
β-actin
GAPDH
注：条带从左至右共4个条带，依次为1. 1 2. N 3. M 4. B
表1 第一组Western blot结果的半定量灰度分析
| 组别 | ACTIN | GAPDH | GAPDH/ACTIN | rate to mock |
| 1 | 111290 | 8912.81 | 0.080086 | 0.098086 |
| N | 94006.9 | 103993 | 1.106227 | 1.354853 |
| M | 99911.6 | 81577.1 | 0.816493 | 1 |
| B | 71434.8 | 56962.7 | 0.797408 | 0.976626 |
GenePharma shRNA 表达载体使用说明
在使用载体法针对某一基因进行 RNＡ干扰 研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因抑制效率的检测。
1、 实验对照组的确立在一个完善的 RNA 干扰实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。通常，这些对照组包括阴性对照、阳性对照、转染试剂对照。
阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组， 在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（shNC），可以表达与目的基因序列无同源性的 siRNA 片段；另一种是将目的 siRNA 的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。
阳性对照组的设立对于 RNA 干扰研究是很有必要的，尤其对于第一次接触 RNA 干扰的用 户而言。您可以利用阳性对照来确认RNAi 实验中转染、RNA 提取和基因表达检测方法的可靠性。阳性对照通常采用已验证的对某些基因有效抑制的 siRNA 片 段。本试剂盒中包括针对人 GAPDH 基因的表达载体（shGAPDH），该载体在导入细胞中后，可以有效抑制 GAPDH 基因的表达。吉玛还向用户提供其他的阳性对照以资选择，详细情况请参见本公司的产品目录或《RNAi 产品使用手册》。
2、 细胞转染条件的确定
使用 DNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测 DNA 的导入情况。最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。吉玛公司提供的 shRNA 表达载体有一部分载体中包含绿色荧光蛋白的表达框架，转入细胞后可以表转染效率；如果您所定购的载体中不含绿色荧光蛋白的表达框架，您可以先 使用可 以表达绿色 荧光蛋 白的表达 载体来确定 转染效率和转染条件，然后使用同样的条件来转染 shRNA 表达载体。
还用一种方法可以用于 确定转染条件，就是采用阳性对照载体来转染细胞（如 shGAPDH），检测对照载体对基因的抑制效率，然后采用抑制效率较高时的转染条件来进一步转染 shRNA 表达载体。
RNA 干扰实验操作
由于在 RNA 干扰实 验中有多 种条件选 择如试剂 和细胞 株等，在本实验操作中以 shNC 为阴性对照，shGAPDH 为阳性对照，RNAi-Mate 为转染试剂，Hela 细胞为实验细胞株，按照上述条件分步阐述 RNA 干扰实验的操作过程。如果用户使用不同的细胞株和转染试剂，可根据吉玛公司的《RNAi 产品使用手册》进行相应的调整。
1 转染条件的确定
如果您所定购的载体中不含绿色荧光蛋白的表达框架，您可以先 使用可 以表达绿色 荧光蛋 白的表达 载体来确定 转染效 率和转染条件，然后使用同样的条件来转染 shRNA 表达载体。 还用一种方法可以用于 确定转染条件，就是采用阳性对照载体来转染细胞（如 shGAPDH），检测对照载体对基因的抑制效率，然后采用抑制效率较高时的转染条件来进一步转染 shRNA 表达载体。
1、转染前一天，接种 0.4-1.0×10 细胞/孔至 24 孔板中，加入 500μl 含血清培养液，37℃ 5% CO2 培养如果您选用可表达绿色荧光蛋白 的 pGPU6/GFP/Neo 或pGPH1/GFP/Neo 载体，可以直接用这些载体来确定转染效率；如果选用其他载体，可用其他表达绿色荧光蛋白的载体来确定转染条件，或使 用 阳 性 对 照 载 体 如shGAPDH 来去 确 定 转 染条件。 选用生理状态良好的细胞对提高 转染效 率很重 要。DNA的用量及其与转染试剂的比例可在 推荐范围 内适当调整。
2、 在 50 μl Opti-MEM I 培养液或其它无血清培养液中加入 0.5-0.8μg DNA，混匀。
3、 使用前轻轻混匀 RNAi-Mate 试剂，切忌离心处理。用 30μl 无血清的 DMEM 或 Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释 1-4μg RNAi-Mate 试剂（可以分别设立 DNA/RNAi-Mate 的不同用量组，通常 DNA和 RNAi-Mate 的用量在 1：2-1：5 范围内，针对不同的细胞需要不同的用量），轻轻混匀，室温放置 5 分钟。
4、 将稀释好的 siRNA 和 RNAi-Mate 试剂混合，定容到 100μl；轻柔混匀，室温放置 30 分钟，以便形成 siRNA/RNAi-Mate（或 DNA/RNAi-Mate）复合物。
5、 将 100μl DNA/RNAi-Mate 复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板，使 DNA/RNAi-Mate 混合物均匀覆盖细胞。
6、 细胞在 CO2 培养箱中 37℃温育 24h-48h 后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育 4-6 小时后，除去复合物，更换培养基。
7、 如果使用可以表达绿色荧光蛋白的 DNA 载体来检测细胞的转染效率，细胞转染后 24-48 h 后，使用荧光显微 镜观察计数表达绿色荧光蛋白的细胞，在明场观 察计数同一视野中的总细胞数，转染细胞率 =荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×100%。或使用 DAPI 等染料染核后，使用流式细胞仪进行计数，然后计算转染效率。
8、 也可使用阳性对照的抑制率来标定转染效率。例如使用 shGAPDH 来抑制细胞内 GAPDH 基因的表达，如果转染效率较高，shGAPDH 对 GAPDH 基因的 mRNA 和蛋白水平的抑制率通常分别为 50-90%和50-90%。反之，如果 shGAPDH 对 GAPDH 基因表现出较高的抑制率，也表明细胞的转染效率较高，可以满足进一步实验需要。
9、 如果在转染条件摸 索实验中没有找到较高 效率的转染方法，请更换转 染方法和试剂。如无其他方 法选择，可以 使用流式细胞仪将转染的细胞分选出来用于后续实验。如果 无法分选细胞，可以在计算 RNA干扰抑制效率时去除转染效率的影响，也可以使用抗生素对转染后的细胞进行初筛后再进一步检测抑制效率。
2 细胞的转染
1、 设定合理的实验组，包括转染试剂对照（mock transfection）、阴性对照(negative control)、阳性对照（positive control）和目的基因实验组。
2、 按照前面实验确定的细胞接种量接种。37ºC 5% CO2 培养至 40-70%融合。
3、 按照前面实验确定的转染条件转染细胞。如果需要转染不同培养量的细胞，试剂的用量可以根据本公司《RNAi 产品使用手册》第 9 页和第 13 页所述进行相应的变化。
4、 转染后 24-48h 后，收集细胞进行下一步的检测工作。通常，目的基因在转染后 24-48h 内就会表现出表达抑制，但有一些蛋白比如稳定性较强、半衰期较长的蛋白在转染后含量降低比较缓慢，所以需要延长检测时间。
3 基因抑制效率的检测
1、 在本公司的《RNAi 产品使用手册》 14 页-19 页）中较详细地介绍了使用荧光定量 PCR 技术和 Westernblot 方法检测目的基因表达变化的操作步骤和注意事项，用户可以酌情选用。
2、 用户也可选用其他间接的方法（如目的基因的生物学功能或细胞生物学特性的变化）来检测目的基因的抑制情况。鉴于这方面的检测手段多种多样，需要用户自己进行选择，在此不再赘述
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目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类：
1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具
产品价格 本产品目录中标示的价格均为国内统一零售参考价，全部为人民币价格。如果大量定购时，在标准价格的基础上有不同程度的优惠。
质量保证 凡吉玛公司的产品均有严格的质量保证。如果我们发现确实存在质量问题时，保证更换产品。如果在到货后一个月之内用户无提出异议，我们将视本产品为优良产品而不再受理投诉事宜。提出产品异议（或投诉）时，切莫在产品使用完（或快使用完）后提出，以备本公司回收产品，确认产品质量。由于订错产品而产生的退货情况，原则上由客户承担相关费用。发生投诉事宜时，公司只保证在产品价格额度范围之内酌情赔偿，恕不受理超过制品价格额度以上之部分。退款时需退还原始发票。
我们保证：序列正确，符合设计原则； 质量（偏差±10%）和纯度达标公司质控标准，转染293T细胞无污染，单独加质粒无明显细胞毒性（配合转染试剂引起除外）。
shRNA载体：不保证转染效率，不保证干扰效果。如果客户根据有效siRNA序列，改成shRNA，存在无效风险，我们只保证序列正确，不保证干扰效果。
shRNA载体套餐：1. 不保证转染效率，转染效率良好的情况下（>80%），保证mRNA水平70%干扰效果（下限偏差不超过5%），无效可以免费重新提供一次靶点（款到发货）或退票退款或做预付款，如果重新合成款到发货，再次无效，则不再接受投诉处理；
2. 如果是提供蛋白结果，或者是lncRNA，或者非人和鼠的其他哺乳动物物种，只重合一次，重合还是无效也不再处理，客户货款正常支付。
3. cirRNA、非哺乳动物或者其他不适合提供套餐服务的基因，不提供套餐，不保证干扰效果。
备注：
1. 以上无效需经过公司确认，如果验证符合公司出货标准，客户仍需支付相关费用。
2. 所有阳性或有效性确认，不同细胞表达调控不同，所以只需一种细胞或样品确认效果即可，不保证所有细胞或样品一定符合阳性结果。
3. 所有实验仅供科研使用。
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