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公司产品
过表达慢病毒
慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。而慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
慢病毒包装系统一般由慢病毒表达载体和慢病毒包装载体组成。
慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。而慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。
慢病毒系统可以转染多种细胞类型如原代细胞、干细胞、非分裂细胞等，实现可重复的稳定表达。对于一些较难转染的细胞，慢病毒系统采用病毒包装外源基因方式进入细胞并稳定表达，是一种理想的基因表达工具。慢病毒通过顺式作用元件将病毒运送入细胞核，将所要表达的基因序列重组整合到细胞的基因组中，从而实现目的序列持续稳定的高表达。
吉玛公司倾情推出过表达慢病毒系列产品，为广大科研工作者提供有力的过表达手段，解决转染效率低的难题。
吉玛公司过表达慢病毒交货期限及收费标准：
| 产品 | 规格 | 报价（元） | 生产周期（工作日） |
| 过表达慢病毒1（≤300bp） | 10^8TU/ml | ￥4880 | 40 |
| 过表达慢病毒2（≤300bp） | 10^9TU/ml | ￥5880 | 40 |
| 过表达慢病毒3（≤3000bp） | 10^8TU/ml | 基因数*2+￥3880 | 40-60 |
| 过表达慢病毒4（≤3000bp） | 10^9TU/ml | 基因数*2+￥4880 | 40-60 |
备注：慢病毒需要干冰件运输，除江浙沪外所有地区，需要加收￥300 运费。
吉玛公司全基因合成真核过表达载体类型：
载体名称(编号)
目的基因启动子
荧光标签
真核抗性
LV4
EF-1a
GFP
--
LV5
EF-1a
CopGFP
Puro
LV6
EF-1a
--
Puro
LV7N
EF-1a
mCherry
--
LV8N
EF-1a
mCherry
Puro
LV11
CMV
--
Neo
LV11A(LV11-CMV-MCS-hPGK-GFP-Puro)
CMV
CopGFP
Puro
LV11B(LV11-CMV-MCS-hPGK-mCherry-Puro)
CMV
mCherry
Puro
LV13
EF-1a
luci05
Puro
LV14
EF-1a
luci17
--
LV17
EF-1a
luci17
Puro
LV18
CMV
--
Puro
LV18A(LV18-EF-1a-MCS-CMV-mCherry-T2A-Puro)
EF-1a
mCherry
Puro
LV18B(LV18-EF-1a-MCS-hPGK-mCherry-T2A-Puro)
EF-1a
mCherry
Puro
LV18C(LV18-CMV-T2A-Neo)
CMV
--
Neo
LV18D(CMV-MCS-hPGK-mCherry-T2A-Puro)
CMV
mCherry
Puro
LV18E(CMV-MCS-mPGK-GFP-T2A-Puro)
CMV
GFP
Puro
|
注意事项： 1、上述价格均不包括运输费用。江浙沪地区1、上述价格均不包括运输费用。江浙沪地区免收运费，其它城市或地区收取干冰寄送费用300元。 2、本公司原则上只提供假病毒颗粒形式的慢病毒产品。如果客户需要我们提供上游构建的干扰穿梭载体，则需要额外支付相应的穿梭载体购买费用（1000元/个），过表达慢病毒的穿梭载体不予提供。 3、如客户所需包装的目的基因由客户提供，则客户应提供所要构建慢病毒的目的基因的序列及其它相关说明信息（例如装载载体、质粒图谱、酶切位点等）。客户应对所提供的材料及信息负责，如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。 4、由于过表达慢病毒滴度有可能收到表达基因及其长度影响，如第一次包装未达到滴度则重新包装一次，如果仍未达到滴度则按实际滴度出货，客户至少需付货款金额的50%。实验周期相应延长；客户基因中存在特殊序列或基因结构复杂（如：10bp以上的重复序列；8bp以上的同一碱基的连续结构；GC含量超过70%等）时需视具体情况另行协商收费标准。 5、如客户需委托本公司使用包装好的慢病毒感染目的细胞，建立稳定表达目的基因或目的shRNA的细胞系，则相关实验费用另外计算。 6、例如按照10^8TU的规格包装滴度在10^7~10^8TU/ml,我们认为是合格的，如果低于10^7TU/ml,我们会再重新包装一次，如果滴度依旧很低，我们会与客户沟通协商出货价格，最多减免1000元.但如果操作没问题，通常不会再次反复包装，如果不接受，可以不发货不收款，miRNA相关病毒只保证序列、滴度达到要求，效果不同细胞不予保证。对于特殊订单（客户提供穿梭载体、基因较长，特殊结构，需特殊处理表达，基因对细胞正常生长有可能产生影响等），我们通常会收取50%预付款，才能安排生产，而且生产周期要有沟通，而且如果生产对照、实验操作没问题，实验结果达不到预期我们预付款也是要收的。 7、由rnaisupport@genepharma.com联系的订单，订单发送请同时抄送该邮箱，以免订单遗漏沟通有误。 |
| 元件 | 功能 |
| RSV/5'LTR | Hybrid RSV promoter-R/U5 long terminal repeat; required for viral packaging and transcription |
| Psi pack | Packaging signal |
| RRE | Rev response element binds gag and involved in packaging of viral transcripts |
| cPPT | Central polypurine tract (includes DNA Flap region) involved in nuclear translocation and integration of transduced viral genome |
| EF1a promoter | RNA polymerase II promoter for expression of target gene insert |
| CMV promoter | Human cytomegalovirus (CMV)--constitutive promoter for transcription of reporter gene |
| T2A | Thosea asigna virus 2A translational cleavage site containing 18 amino acid residues. Cleavage occurs via a co-translational ribosome skipping mechanism between the C-terminal Glycin and Prolin residues, leaving 17 residues attached to the end of copGFP and 1 residue to the start of the puromycin resistance marker |
| Puro | Puromycin-resistant marker for selection of the ransfected/transduced cells |
| WPRE | Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element-- enhances the stability of the viral transcripts |
| 3' LTR | Required for viral reverse transcription; self- inactivating 3' LTR with deletion in U3 region prevents formation of replication-competent viral particles after integration into genomic DNA |
| Amp | Ampicillin resistant gene for selection of the plasmid in E. coli |
备注：
1. 对于普通线性基因（mRNA/lncRNA）
转染效率良好的情况下（>80%），保证mRNA水平上调有显著性差异（与对照组相比）。
2. 对于CircRNA
保证序列设计符合设计原则，保证序列合成和订单要求一致，保证滴度和体积达到共同保证要求，不保证干扰效果。非承诺质量问题，无效也需付款。
3. 对于Mimic病毒
保证序列正确、滴度和体积达到共同保证要求，一般工具细胞上（比如293T）qPCR能检测到miRNA上调有显著性差异，客户细胞如果检测不到过表达，可以换成前体或者初级体试一下（款到发货）。
目前，我公司慢病毒载体是以国际通用的第三代载体系统为基础，通过一定改建，构成四质粒体系。其中，转移载体（transfer vector）包含转移目的基因的慢病毒骨架及其包装产生相应基因组RNA的所有顺式作用元件，并且可以单一或多重组合的稳定或条件诱导性表达转移基因或shRNA；另外，通过三个辅助质粒，提供病毒包装所需的反式作用因子，同时采用“自我灭活”修饰，阻止子代病毒自我复制和转移，从而确保产生的慢病毒具备良好的生物安全性。
生物安全
1、安全性
（1）删除了全部HIV-1的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任何HIV-1蛋白的表达；
（2）对5’和3’ LTR分别进行了删除改造，5’LTR缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR删除U3，使其不再具有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体；
（3）病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分别独立放置在3个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；
（4）与MuLV等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低；
（5）慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有4千万人感染了HIV-1，发生的整合事件不计其数，但未出现一起致瘤事件，而MuLV等逆转录病毒载体有致瘤活性；
（6）慢病毒的LTR的转录激活能力低于逆转录病毒，激活原癌基因能力也相对较低。
2、实验室安全措施
慢病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型慢病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕。所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免䚧生溶胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛慢病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶，使用培养板来感染病毒，要防止意外洒落。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示。
成功案例
病毒滴度测定：
吉玛基因实验室细胞推荐Lentivirus感染参数：
| 细胞系慢病毒感染参数 | |||||
|
名称 |
ATCC No. |
细胞类型及来源 |
达到80%感染所需MOI |
||
| 293T | CRL-11268 | 人胚胎肾细胞 | 1 | ||
| 95D | —— | 人高转移肺腺癌细胞 | 3 | ||
| CNE-1 | —— | 人鼻咽癌细胞（高分化） | 50 | ||
| hADSC | —— | 人脂肪肝细胞 | 100 | ||
| HEC-1B | HTB-113 | 人子宫内膜癌细胞 | 5 | ||
| Hep-2 | —— | 人喉表皮样癌细胞 | 20 | ||
| hFOB1.19 | —— | 永生化人成骨细胞 | 2 | ||
| HL-60 | CCL-240 | 人原髓细胞白血病细胞 | 50 | ||
| HLE-B3 | —— | 人晶状体上皮细胞 | 1 | ||
| hMSC | —— | 人骨髓间充质干细胞 | 50 | ||
| hSMC | —— | 人平滑肌细胞 | 50 | ||
| HUVEC | —— | 人脐静脉内皮细胞 | 5 | ||
| Jurkat | TIB-152 | 人白血病细胞 | 100 | ||
| MCF-7 | HTB-22 | 人乳腺腺癌细胞 | 5 | ||
| MDA-MB-231 | HTB-26 | 人乳腺癌细胞 | 10 | ||
| SaoS-2 | —— | 人成骨肉瘤细胞 | 20 | ||
| SGC-7901 | —— | 人胃癌细胞 | 5 | ||
| SHG-44 | —— | 人胶质瘤细胞 | 10 | ||
| SKOV-3 | HTB-77 | 人卵巢癌细胞 | 5 | ||
| SMMC-7721 | —— | 人肝癌细胞 | 1 | ||
| SPC-A-1 | —— | 人肺腺癌细胞 | 10 | ||
| THP-1 | TIB-202 | 人单核细胞 | 100 | ||
| U251 | —— | 人胶质瘤细胞 | 1 | ||
| U-20S | HTB-96 | 人骨癌细胞 | 5 | ||
| U937 | CRL-1593.2 | 人组织细胞淋巴瘤细胞 | 100 | ||
| HSC-T6 | —— | 永生化大鼠肝星型细胞 | 3 | ||
| PC-12 | CRL-1721 | 大鼠肾脏嗜铬细胞 | 100 | ||
| H9c2(2-1) | CRL-1446 | 大鼠心肌细胞 | 1 | ||
| KM3 | —— | 大鼠骨髓癌细胞（B淋巴细胞） | 50 | ||
|
原代培养细胞慢病毒感染参数 |
|||||
| 细胞名称 | 种属 | 细胞类型及来源 | 达到80%感染所需MOI | ||
| 甲状旁腺原代细胞 | 人 | 甲状旁腺组织 | 50 | ||
| 胚椎间骨髓核细胞 | 人 | 胚胎组织 | 5 | ||
| 血管平滑肌细胞 | 大鼠 | 血管平滑肌 | >100 | ||
| 胶质细胞 | 大鼠 | 脑组织0 | 5 | ||
| 培养器皿 | 底面积（cm2） | 加培养液量（mL） | 可获细胞量 |
| 96孔培养板 | 0.32 | 0.1 | 0.5-2.0×10^4 |
| 48孔培养板 | 0.8 | 0.2 | 0.2-1×10^5 |
| 24孔培养板 | 1.9 | 1.0 | 0.5-2×10^5 |
| 12孔培养板 | 3.8 | 2.0 | 1-4×10^5 |
| 6孔培养板 | 9.6 | 2.5 | 3-8×10^5 |
| 3.5cm培养皿 | 9.6 | 3.0 | 3-8×10^5 |
| 6cm培养皿 | 28 | 5.0 | 1-3×10^6 |
| 9cm培养皿 | 49 | 10.0 | 2-5×10^6 |
| 10cm培养皿 | 55 | 10.0 | 3-8×10^6 |
| 25cm塑料培养瓶 | 25 | 5.0 | 5×10^6 |
| 75cm塑料培养瓶 | 75 | 15-30 | 2×10^7 |
| 25cm玻璃培养瓶 | 19 | 4.0 | 3×10^6 |
| 100cm玻璃培养瓶 | 37.5 | 10.0 | 6×10^6 |
| 250cm玻璃培养瓶 | 78 | 15.0 | 2×10^7 |
| 2500cm旋转培养瓶 | 700 | 100-250 | 2.5×10^8 |
Lentivirus在细胞水平使用
GenePharma提供的重组Lentivirus颗粒是以VSV-G膜蛋白包裹，从而大大增加了病毒感染谱，但对不同组织细胞亲嗜性仍有差别，因此，有必要在使用Lentivirus颗粒之前请查阅有关文献，了解Lentivirus对靶细胞的亲嗜性、感染复数（MOI值）及体内（in vivo）注射所需的病毒量，若无相应文献支持，则需要检测病毒对靶细胞的亲嗜性。
1、病毒滴度复核（有限稀释法测定）
（1）滴度检测前一天，对293T细胞传代，96孔板每个孔加入约5×104cells/ml，体积50~100ul；
（2）第二天，准备3~5个无菌EP管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基（高糖DMEM+10%FBS）；
（3）取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；
（4）选取所需的细胞孔，吸弃90ul培养液，然后将稀释好的病毒液，从低浓度到高浓度依次加入，放入37℃ 5% CO2培养箱中培养；
（5）48小时后，每孔加入100ul新鲜培养液，小心操作，不要吹起细胞；
（6）3~4天后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最后二个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数，将得到的数值除以各自相应的稀释倍数，即可计算出病毒原液的滴度值（通常以倒数第二个孔中的读数值更为准确）。
注释：
（1）典型的病毒滴度测定结果见图一（Fig. 1）；
（2）病毒滴度测定结果还依赖于本身实验系统，如293T细胞代数、细胞状态、荧光显微镜品质、相关实验试剂及实验人员操作技能，因此不同实验室测得滴度数值会有所差异（1~5倍），但基本不会影响正常实验流程；
（3）病毒滴度(BT = TU/ml, transducing units)计算公式： TU/μl = (P × N / 100 × V) ×1/DF， P = % GFP+ cells，N = 转染时的细胞数V =每孔加入病毒稀释液体积（μl），DF =稀释因子（dilution factor）= 1 (undiluted)、10–1 (diluted 1/10)、 10–2 (diluted 1/100)。
常用慢病毒滴度检测方法比较
| 名称 | 原理 | 单位 | 特点 | 优缺点 | 与GFP荧光法相比 |
| p24核心蛋白定量法 | ELISA Kit 1 |
ng p24/ml LP/ml TU/ml（估计） |
物理（颗粒）滴度 | 经典方法，简单、重复性好 | 高估102~103倍 |
| RNA基因组定量法 | RT-qPCR |
RNA/ml、 Vg/ml TU/ml（估计） |
物理（核酸）滴度 | 精度高，但对仪器和操作要求高 | 高估102~104倍 |
| GFP荧光计数法 | FACS（流式细胞计数） | TU/ml | 感染滴度 | 经典方法，简单、重复性好 | - |
| 抗性克隆计数法 | 细胞克隆计数 | TU/ml | 感染滴度 | 克隆形成需约2周 | 低估5~10倍 |
| Dot-blot法 | RNA dot-blot | RNA/ml | 物理（核酸）滴度 | 简单，但属于半定量 | |
| DNA 定量法 | 感染细胞后定量载体DNA | TU/ml | 感染滴度 | 最接近真实感染滴度，但不同细胞感染效率不同 |
2、 靶细胞感染预实验
（1）实验前一天分别接种3~5×103 个靶细胞于96孔培养板每孔中，所加培养基体积为100µl ，不同种类的细胞生长速度有所差异，为保证有较好的实验结果，进行病毒感染时细胞的融合率为40%~60%，因为Lentivirus表达时间较长，故在进行感染时细胞接种不宜过密；
（2）感染预实验应分为3组，每组均有三个不同梯度的MOI值（Multiply of Infection）。第一组为正常情况下感染，即在完全培养基中直接加入病毒。第二组为感染时添加5µg/ml Polybrene，Polybrene针对多数细胞可有效提高病毒感染效率（3~6倍）；
（3）感染前为细胞换液，吸取细胞上清，按不同的分组情况加入所需的培养基90µl，每组三个孔；
（4）准备2个无菌的EP管，在每个管中加入90ul的稀释液，吸取10ul ~20ul的1×10^8TU/ml的病毒液（预先从-80℃取出迅速融化，而后将病毒放置于4度下进行操作），依次10倍稀释，轻轻混匀，请勿产生气泡，这样既可得到三个病毒梯度：10、100及1000倍病毒稀释液；
（5）将三个不同梯度的病毒加到每组的三个孔中，计算可知，三个孔的MOI分别为100、10、1，如果所用的病毒滴度未达到1×10^8TU/ml，则相应增加病毒体积使得能够得到不同的MOI；
（6）把细胞板放回细胞培养箱孵育；
（7）8~12hrs以后请观察细胞状态，如果细胞状态与未感染组无明显差异，表明lentivirus对细胞没有明显的毒性作用，请不要换液，继续培养，24h后更换为新鲜培养基培养；
（8）感染3~4天后，观察荧光表达情况。对于生长迟缓代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的良好生长状态；
（9）以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上，它不是需要提前一天分盘。操作时直接将细胞离心后悬浮在不同的培养基中，计数分盘后，即可以加入病毒；
（10）通过首次实验和重复实验，确定目的细胞的感染方法和感染参数。结果参见如下实例。
3、正式试验
通过预实验可以帮助确定使用重组Lentivirus颗粒感染目的细胞的优化条件，如细胞接种密度，是否需要添加Polybrene，合适的MOI值等参数。正式实验前，调整并保持细胞的良好状态是非常重要的。有些对Polybrene敏感，这时候就不能添加Polybrene去增强感染效率。
Lentivirus表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如293T，BHK21等）上，病毒感染24hrs后可以观察到GFP（或者RFP）荧光；代谢比较缓慢的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）GFP（或者RFP）蛋白表达时间较长，感染后72-96hrs甚至更长时间才可以观察到GFP（或者RFP）荧光。感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察GFP（或者RFP）的表达时间和表达强度来确定Lentivirus对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态。
运输和储存
对于长距离运输，应先将慢病毒载体保存在-80℃，再采用全程干冰运输，以防滴度下降。 慢病毒载体在-80℃保存6个月，滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融（小于3次）。 使用前从-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其尽快溶解，操作过程应置于冰盒上进行。用不完的病毒可以暂时放在4℃冰箱中，但最好尽快用完。
常见问题及解决方案：
1.Q：通常在转移载体中最大能够插入多大的目的基因序列？
A:基于HIV基因骨架的原因，通常插入的目的基因序列要小于4kb，否则会影响病毒滴度甚至基因表达。
2.Q:Lentivirus对目的细胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？
A:一般，我们通过提高MOI值来提高病毒的转染效率，必要时以在培养基中加入Polybrene（4~8µg/ml）来提高病毒的感染效率。同时，目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证。
3.Q;lentiviirus感染，但是GFP荧光强度很弱，为什么？
A:中GFP荧光强度取决于病毒感染细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型以及观察时间等。一般来讲，目的细胞感染病毒颗粒数越多，细胞本身增殖越快，GFP荧光会越强。Lentivirus属于慢病毒，一般在增殖较快的细胞中病毒感染72~96h后，GFP基因表达才达到高峰。对于增殖较慢的细胞，GFP基因表达时间还会延长。
4.Q:感染病毒后，目的细胞死亡很厉害，为什么？
A:lentivirus可能对您的目的细胞有一定的毒性，请调整并降低感染的MOI值，并且在4hrs，8hrs或者12hrs后对细胞进行换液，用新鲜的完全培养液继续培养观察。
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目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类：
1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具
产品价格 本产品目录中标示的价格均为国内统一零售参考价，全部为人民币价格。如果大量定购时，在标准价格的基础上有不同程度的优惠。
质量保证 凡吉玛公司的产品均有严格的质量保证。如果我们发现确实存在质量问题时，保证更换产品。如果在到货后一个月之内用户无提出异议，我们将视本产品为优良产品而不再受理投诉事宜。提出产品异议（或投诉）时，切莫在产品使用完（或快使用完）后提出，以备本公司回收产品，确认产品质量。由于订错产品而产生的退货情况，原则上由客户承担相关费用。发生投诉事宜时，公司只保证在产品价格额度范围之内酌情赔偿，恕不受理超过制品价格额度以上之部分。退款时需退还原始发票。
交通运输 吉玛公司承诺以最快捷的运送方式保证用户及时收到订购的产品。由总部直接发货，如一次订货达1，000元可免运费；不足1，000元的订货，我们根据具体情况酌情收费(上海地区免运费）。我们公司产品一般采用快递方式发货。另外对应需要特殊运输的产品（例如病毒产品等冷链运输产品）需要收取300元的特殊运输费用。
下单前请务必核对订购表客户信息和订购内容无误，订单一经确认，当天即启动生产。 超过当日17：00后不能修改或者取消，如果需要取消订单，由此产生的费用，将由客户承担。
【取消订单费用规则】
（1）当日17：00前，免费修改或取消。
（2）当日17：00到次日17：00前，按该项产品金额的50%收取。
（3）次日17：00后，按该项产品金额的100%收取。
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