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慢病毒包装服务
吉玛公司倾情推出慢病毒系列产品，为广大科研工作者在新的一年里提供有力的干扰手段，解决转染效率低，抑制效率不高的难题。我们的慢病毒包装快速（3-4周），性价比高，定制1ml滴度为10的9次方TU的病毒液只需要3880元/ml。
吉玛公司倾情推出慢病毒系列产品，滴度最高可达10^10TU/ml，为广大科研工作者在新的一年里提供有力的干扰手段，解决转染效率低，抑制效率不高的难题。我们的慢病毒包装快速（3-4周），性价比高，定制1ml滴度为10^9TU的病毒液只需要3880元/ml。
吉玛公司可提供多种滴度的慢病毒液
| 滴度 | 规格 | 报价 | 如果由于表达基因影响正常细胞状态，造成病毒滴度未达到要求，则按照实际包装病毒滴度收费，低于10^8TU/ml，则免费包装一次，并以实际最高包装滴度发货。 |
| 1*10^8TU/ml | 1ml | ￥2880 | |
| 1*10^9TU/ml | 1ml | ￥3880 |
吉玛提供多种多样的慢病毒构建服务
目前，我公司慢病毒载体是以国际通用的第三代载体系统为基础，通过一定改建，构成四质粒体系。其中，转移载体（transfer vector）包含转移目的基因的慢病毒骨架及其包装产生相应基因组RNA的所有顺式作用元件，并且可以单一或多重组合的稳定或条件诱导性表达转移基因或shRNA；另外，通过三个辅助质粒，提供病毒包装所需的反式作用因子，同时采用“自我灭活”修饰，阻止子代病毒自我复制和转移，从而确保产生的慢病毒具备良好的生物安全性。
生物安全
1、安全性
（1）删除了全部HIV-1的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任何HIV-1蛋白的表达；
（2）对5’和3’ LTR分别进行了删除改造，5’LTR缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR删除U3，使其不再具有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体；
（3）病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分别独立放置在3个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；
（4）与MuLV等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低；
（5）慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有4千万人感染了HIV-1，发生的整合事件不计其数，但未出现一起致瘤事件，而MuLV等逆转录病毒载体有致瘤活性；
（6）慢病毒的LTR的转录激活能力低于逆转录病毒，激活原癌基因能力也相对较低。
2、实验室安全措施
慢病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型慢病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕。所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免䚧生溶胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛慢病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶，使用培养板来感染病毒，要防止意外洒落。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示。
成功案例
病毒滴度测定：
吉玛基因实验室细胞推荐Lentivirus感染参数：
| 细胞系慢病毒感染参数 | |||||
| 名称 | ATCC No. | 细胞类型及来源 | 达到80%感染所需MOI | ||
| 293T | CRL-11268 | 人胚胎肾细胞 | 1 | ||
| 95D | —— | 人高转移肺腺癌细胞 | 3 | ||
| CNE-1 | —— | 人鼻咽癌细胞（高分化） | 50 | ||
| hADSC | —— | 人脂肪肝细胞 | 100 | ||
| HEC-1B | HTB-113 | 人子宫内膜癌细胞 | 5 | ||
| Hep-2 | —— | 人喉表皮样癌细胞 | 20 | ||
| hFOB1.19 | —— | 永生化人成骨细胞 | 2 | ||
| HL-60 | CCL-240 | 人原髓细胞白血病细胞 | 50 | ||
| HLE-B3 | —— | 人晶状体上皮细胞 | 1 | ||
| hMSC | —— | 人骨髓间充质干细胞 | 50 | ||
| hSMC | —— | 人平滑肌细胞 | 50 | ||
| HUVEC | —— | 人脐静脉内皮细胞 | 5 | ||
| Jurkat | TIB-152 | 人白血病细胞 | 100 | ||
| MCF-7 | HTB-22 | 人乳腺腺癌细胞 | 5 | ||
| MDA-MB-231 | HTB-26 | 人乳腺癌细胞 | 10 | ||
| SaoS-2 | —— | 人成骨肉瘤细胞 | 20 | ||
| SGC-7901 | —— | 人胃癌细胞 | 5 | ||
| SHG-44 | —— | 人胶质瘤细胞 | 10 | ||
| SKOV-3 | HTB-77 | 人卵巢癌细胞 | 5 | ||
| SMMC-7721 | —— | 人肝癌细胞 | 1 | ||
| SPC-A-1 | —— | 人肺腺癌细胞 | 10 | ||
| THP-1 | TIB-202 | 人单核细胞 | 100 | ||
| U251 | —— | 人胶质瘤细胞 | 1 | ||
| U-20S | HTB-96 | 人骨癌细胞 | 5 | ||
| U937 | CRL-1593.2 | 人组织细胞淋巴瘤细胞 | 100 | ||
| HSC-T6 | —— | 永生化大鼠肝星型细胞 | 3 | ||
| PC-12 | CRL-1721 | 大鼠肾脏嗜铬细胞 | 100 | ||
| H9c2(2-1) | CRL-1446 | 大鼠心肌细胞 | 1 | ||
| KM3 | —— | 大鼠骨髓癌细胞（B淋巴细胞） | 50 | ||
| 原代培养细胞慢病毒感染参数 | |||||
| 细胞名称 | 种属 | 细胞类型及来源 | 达到80%感染所需MOI | ||
| 甲状旁腺原代细胞 | 人 | 甲状旁腺组织 | 50 | ||
| 胚椎间骨髓核细胞 | 人 | 胚胎组织 | 5 | ||
| 血管平滑肌细胞 | 大鼠 | 血管平滑肌 | >100 | ||
| 胶质细胞 | 大鼠 | 脑组织0 | 5 | ||
| 培养器皿 | 底面积（cm2） | 加培养液量（mL） | 可获细胞量 |
| 96孔培养板 | 0.32 | 0.1 | 0.5-2.0×10^4 |
| 48孔培养板 | 0.8 | 0.2 | 0.2-1×10^5 |
| 24孔培养板 | 1.9 | 1.0 | 0.5-2×10^5 |
| 12孔培养板 | 3.8 | 2.0 | 1-4×10^5 |
| 6孔培养板 | 9.6 | 2.5 | 3-8×10^5 |
| 3.5cm培养皿 | 9.6 | 3.0 | 3-8×10^5 |
| 6cm培养皿 | 28 | 5.0 | 1-3×10^6 |
| 9cm培养皿 | 49 | 10.0 | 2-5×10^6 |
| 10cm培养皿 | 55 | 10.0 | 3-8×10^6 |
| 25cm塑料培养瓶 | 25 | 5.0 | 5×10^6 |
| 75cm塑料培养瓶 | 75 | 15-30 | 2×10^7 |
| 25cm玻璃培养瓶 | 19 | 4.0 | 3×10^6 |
| 100cm玻璃培养瓶 | 37.5 | 10.0 | 6×10^6 |
| 250cm玻璃培养瓶 | 78 | 15.0 | 2×10^7 |
| 2500cm旋转培养瓶 | 700 | 100-250 | 2.5×10^8 |
Lentivirus在细胞水平使用
GenePharma提供的重组Lentivirus颗粒是以VSV-G膜蛋白包裹，从而大大增加了病毒感染谱，但对不同组织细胞亲嗜性仍有差别，因此，有必要在使用Lentivirus颗粒之前请查阅有关文献，了解Lentivirus对靶细胞的亲嗜性、感染复数（MOI值）及体内（in vivo）注射所需的病毒量，若无相应文献支持，则需要检测病毒对靶细胞的亲嗜性。
1、病毒滴度复核（有限稀释法测定）
（1）滴度检测前一天，对293T细胞传代，96孔板每个孔加入约5×10^4cells/ml，体积50~100ul；
（2）第二天，准备3~5个无菌EP管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基（高糖DMEM+10%FBS）；
（3）取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；
（4）选取所需的细胞孔，吸弃90ul培养液，然后将稀释好的病毒液，从低浓度到高浓度依次加入，放入37℃ 5% CO2培养箱中培养；
（5）48小时后，每孔加入100ul新鲜培养液，小心操作，不要吹起细胞；
（6）3~4天后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最后二个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数，将得到的数值除以各自相应的稀释倍数，即可计算出病毒原液的滴度值（通常以倒数第二个孔中的读数值更为准确）。
注释：
（1）病毒滴度测定结果还依赖于本身实验系统，如293T细胞代数、细胞状态、荧光显微镜品质、相关实验试剂及实验人员操作技能，因此不同实验室测得滴度数值会有所差异（1~5倍），但基本不会影响正常实验流程；
（2）病毒滴度(BT = TU/ml, transducing units)计算公式： TU/μl = (P × N / 100 × V) ×1/DF， P = % GFP+ cells，N = 转染时的细胞数V =每孔加入病毒稀释液体积（μl），DF =稀释因子（dilution factor）= 1 (undiluted)、10–1 (diluted 1/10)、 10–2 (diluted 1/100)。
常用慢病毒滴度检测方法比较
| 名称 | 原理 | 单位 | 特点 | 优缺点 | 与GFP荧光法相比 |
| p24核心蛋白定量法 | ELISA Kit 1 |
ng p24/ml LP/ml TU/ml（估计） |
物理（颗粒）滴度 | 经典方法，简单、重复性好 | 高估102~103倍 |
| RNA基因组定量法 | RT-qPCR |
RNA/ml、 Vg/ml TU/ml（估计） |
物理（核酸）滴度 | 精度高，但对仪器和操作要求高 | 高估102~104倍 |
| GFP荧光计数法 | FACS（流式细胞计数） | TU/ml | 感染滴度 | 经典方法，简单、重复性好 | - |
| 抗性克隆计数法 | 细胞克隆计数 | TU/ml | 感染滴度 | 克隆形成需约2周 | 低估5~10倍 |
| Dot-blot法 | RNA dot-blot | RNA/ml | 物理（核酸）滴度 | 简单，但属于半定量 | |
| DNA 定量法 | 感染细胞后定量载体DNA | TU/ml | 感染滴度 | 最接近真实感染滴度，但不同细胞感染效率不同 |
2、 靶细胞感染预实验
（1）实验前一天分别接种3~5×103 个靶细胞于96孔培养板每孔中，所加培养基体积为100µl ，不同种类的细胞生长速度有所差异，为保证有较好的实验结果，进行病毒感染时细胞的融合率为40%~60%，因为Lentivirus表达时间较长，故在进行感染时细胞接种不宜过密；
（2）感染预实验应分为3组，每组均有三个不同梯度的MOI值（Multiply of Infection）。第一组为正常情况下感染，即在完全培养基中直接加入病毒。第二组为感染时添加5µg/ml Polybrene，Polybrene针对多数细胞可有效提高病毒感染效率（3~6倍）；
（3）感染前为细胞换液，吸取细胞上清，按不同的分组情况加入所需的培养基90µl，每组三个孔；
（4）准备2个无菌的EP管，在每个管中加入90ul的稀释液，吸取10ul ~20ul的1×10^8TU/ml的病毒液（预先从-80℃取出迅速融化，而后将病毒放置于4度下进行操作），依次10倍稀释，轻轻混匀，请勿产生气泡，这样既可得到三个病毒梯度：10、100及1000倍病毒稀释液；
（5）将三个不同梯度的病毒加到每组的三个孔中，计算可知，三个孔的MOI分别为100、10、1，如果所用的病毒滴度未达到1×10^8TU/ml，则相应增加病毒体积使得能够得到不同的MOI；
（6）把细胞板放回细胞培养箱孵育；
（7）8~12hrs以后请观察细胞状态，如果细胞状态与未感染组无明显差异，表明lentivirus对细胞没有明显的毒性作用，请不要换液，继续培养，24h后更换为新鲜培养基培养；
（8）感染3~4天后，观察荧光表达情况。对于生长迟缓代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的良好生长状态；
（9）以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上，它不是需要提前一天分盘。操作时直接将细胞离心后悬浮在不同的培养基中，计数分盘后，即可以加入病毒；
（10）通过首次实验和重复实验，确定目的细胞的感染方法和感染参数。结果参见如下实例。
3、正式试验
通过预实验可以帮助确定使用重组Lentivirus颗粒感染目的细胞的优化条件，如细胞接种密度，是否需要添加Polybrene，合适的MOI值等参数。正式实验前，调整并保持细胞的良好状态是非常重要的。有些对Polybrene敏感，这时候就不能添加Polybrene去增强感染效率。
Lentivirus表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如293T，BHK21等）上，病毒感染24hrs后可以观察到GFP（或者RFP）荧光；代谢比较缓慢的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）GFP（或者RFP）蛋白表达时间较长，感染后72-96hrs甚至更长时间才可以观察到GFP（或者RFP）荧光。感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察GFP（或者RFP）的表达时间和表达强度来确定Lentivirus对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态。
运输和储存
对于长距离运输，应先将慢病毒载体保存在-80℃，再采用全程干冰运输，以防滴度下降。 慢病毒载体在-80℃保存6个月，滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融（小于3次）。 使用前从-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其尽快溶解，操作过程应置于冰盒上进行。用不完的病毒可以暂时放在4℃冰箱中，但最好尽快用完。
常见问题及解决方案：
1.Q：通常在转移载体中最大能够插入多大的目的基因序列？
A:基于HIV基因骨架的原因，通常插入的目的基因序列要小于4kb，否则会影响病毒滴度甚至基因表达。
2.Q:Lentivirus对目的细胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？
A:一般，我们通过提高MOI值来提高病毒的转染效率，必要时以在培养基中加入Polybrene（4~8µg/ml）来提高病毒的感染效率。同时，目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证。
3.Q;lentiviirus感染，但是GFP荧光强度很弱，为什么？
A:中GFP荧光强度取决于病毒感染细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型以及观察时间等。一般来讲，目的细胞感染病毒颗粒数越多，细胞本身增殖越快，GFP荧光会越强。Lentivirus属于慢病毒，一般在增殖较快的细胞中病毒感染72~96h后，GFP基因表达才达到高峰。对于增殖较慢的细胞，GFP基因表达时间还会延长。
4.Q:感染病毒后，目的细胞死亡很厉害，为什么？
A:lentivirus可能对您的目的细胞有一定的毒性，请调整并降低感染的MOI值，并且在4hrs，8hrs或者12hrs后对细胞进行换液，用新鲜的完全培养液继续培养观察。
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目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类：
1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具
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质量保证 凡吉玛公司的产品均有严格的质量保证。如果我们发现确实存在质量问题时，保证更换产品。如果在到货后一个月之内用户无提出异议，我们将视本产品为优良产品而不再受理投诉事宜。提出产品异议（或投诉）时，切莫在产品使用完（或快使用完）后提出，以备本公司回收产品，确认产品质量。由于订错产品而产生的退货情况，原则上由客户承担相关费用。发生投诉事宜时，公司只保证在产品价格额度范围之内酌情赔偿，恕不受理超过制品价格额度以上之部分。退款时需退还原始发票。
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（2）当日17：00到次日17：00前，按该项产品金额的50%收取。
（3）次日17：00后，按该项产品金额的100%收取。