公司产品

探针法RT-PCR定量产品

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,它设计与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

产品描述

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,它设计与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。





常用的荧光类型:
报告荧光:FAM、HEX、JOE、TET、VIC、NED、CY3、Texas Red、CT5
淬灭荧光:TAMARA、BHQ、MGB-NFQ
参比荧光:ROX


试剂盒组成(20μl 反应体系×100次)

产品特点

1、模板特异性高:只和目的扩增区结合发出信号,不和引物二聚体和非特异性扩增产物结合;

2、多重PCR检测:可以标记不同的荧光基团,实现一管内多种基因扩增和检测;

3、灵敏度高:可以检测5000拷贝以下的基因定量,原因是当靶基因浓度较低时,染料法虽然也能检测到信号,但几乎以非特异性扩增信号为主, 结果不可靠;但探针法虽然信号不如染料法强,但完全是特异性扩增信号,结果是可靠的。

4、RT酶、 taq酶、 miRNA标准品、 逆转录引物、 特性定量引物、 探针溶液、 其他试剂、 质检报告

服务特点

 1、您只需要提供您感兴趣基因的GeneBank登录号。

2、免费设计引物和探针服务。 

3、免费优化反应体系服务。 

4、免费实验过程技术支持服务。

试剂盒原理

本试剂盒采用Displacement probe和TaqMan荧光PCR基因检测技术。



探针法 Hairpin-it miRNAs qRT-PCR 定量试剂盒

目录号

规格

价格

E01011

50 rxns

¥1100

E01012

100 rxns

¥1750

E01013

200 rxns

¥3300

E01014

300rxns

¥4400

E01015

500 rxns

¥6400

探针法Hairpin-it miRNAs定量和u6校准qRT-PCR试剂盒

E22006

50 rxns

¥1760

E22007

100 rxns

¥2800

E22008

200 rxns

¥5300

E22009

300rxns

¥7000

E22010

500 rxns

¥10000

探针法订制基因qRT-PCR 定量试剂盒

E21006

50 rxns

¥1100

E21007

100 rxns

¥1750

E21008

200 rxns

¥3300

E21009

300rxns

¥4400

E22110

500 rxns

¥6400

引物探针套装

F02002 

1nmol

¥850

功能介绍与实验实例

实验数据

使用方法

SYBR染料法在实际运用过程中一个很大的问题就是引物二聚体的非特异性扩增信号对结果的干扰,尤其是在基因表达丰度不是很高的情况下,引物二聚体的信号甚至强过了目的产物扩增的信号,所以在设置反应条件时,会采用三步法来达到优化的目的,下面是一个优化示例: 

3 step PCR  3 step PCR
标准程序 优化程序
95℃  5sec 95℃  5sec
55℃  30sec      60℃~64℃  30sec
72℃  30sec(信号收集)   72℃~76℃  30sec(信号收集)

将55℃提高至60℃~64℃是为了增加引物结合的特异性,信号收集时将72℃提高至72℃~76℃是为了尽量使引物二聚体打开,避免对目的信号的干扰。

而探针法一个显著特点就是只有探针特异性和目的产物结合才能产生信号,非特异性扩增(包括引物二聚体结合)即便发生也无法产生信号,所以对反应程序的优化要比染料法简单多了。通常采用两步法,

【预变性】 95℃ 30 秒 

通常预变性时间为 30 秒,环状质粒和基因组DNA 等难变性的模板可以延长至 1~2 分钟,但时间过长酶容易失活,不推荐使用 2 分钟以上的条件。 

【两步法 PCR】 




Step 温度 时间 说明
变性 95℃ 3~5 秒 Real Time PCR 扩增片段通常在 300 bp 以下,只需要 95℃、3~5 秒的变性设置。
退火/延伸 56~64℃ 20~30 秒    首先采用 60℃、20 秒的条件设定,反应温度可在 56~64℃范围内进行调整。反应性能较差时,可以适当增加这一步的反应时间。


对taqman探针法荧光定量PCR仪通道的设置

使用荧光定量PCR仪器设置荧光通道时遵守的原则是:5’端FAM、3’端BHQ1的探针和SYBR Green I染料采用相同的设置,原因是FAM基团的荧光最大发射波长是518mM,这和SYBR Green I染料的最大发射波长是520nm非常相近,而单色荧光定量PCR仪此通道的发射波长范围通常覆盖了这个波长。

但有些荧光定量PCR仪器对荧光通道的选择有着明确的规定,以ABI 7300为例,正常安装滤光片后,每次上机会被要求设置合适的Reporter dye和quencher dye,其中Reporter dye可供选择的基团有FAM、JOE、NED、VIC、ROX、SYBR,当客户使用探针法时,需要根据探针5’端标记的发光基团作出对应的选择;而客户使用SYBR染料法时,选择SYBR 就可以了。其中仪器quencher dye可供选择的基团有TAMRA和NONE ,同样当客户使用探针法,需要根据探针3’端标记的淬灭基团作出选择,当使用TAMRA作为淬灭基团时,因为TAMRA本身是一种荧光物质,在淬灭报告基团的同时,自身在更高波长处发射荧光,所以quencher dye要选择TAMRA,以减少对报告基团的检测造成的影响;当使用BHQ1、BHQ2、BHQ3、ECLIPSE作为淬灭基团时,因为这些基团不是荧光基团,所以quencher dye选择NONE;而客户使用SYBR染料法时,选择NONE 就可以了。


1. 推荐逆转录反应体系(以Promega逆转录试剂为例):




组份 终浓度 用量/反应
5×RT Buffer 4.0 μl
dNTP (10 mM) 0.375 mM 0.75 μl
miRNA RT Primer(1 μM) 60 nM 1.2 μl
RNasin (40U/μl) 0.5 U/μl 0.25 μl
MML Reverse Transcriptase  (200U/μl) 40 U 0.20 μl
RNA Sample 1-3 μg μl
RNase Free H2O To 20μl




2. 推荐PCR实验体系:



组份 终浓度 用量/反应
2×Real-time PCR Mix 10 μl
miRNA Specific Primer Set(10 μM) 0.2 μM 0.40 μl
miRNA Specific Probe (10 μM) 0.1 μM-0.2 μM 0.20 μl-0.4 μl
rTaq DNA Polymerase (5U/μl) 1U 0.20μl
cDNA  2.0μl
RNase free H2O To 20μl

*cDNA可根据实验经验做适当比例稀释。
* miR Specific Primer Set 包括PCR正反向引物。
 
Real-Time PCR程序:95℃ 3min(根据自己的酶类型调整反应时间)
 
95℃ 12s
40 cycles
60℃ 40s(采集荧光)

产品说明书

相关文献

icroRNA-26a regulates tumorigenic properties of EZH2 in human lung carcinoma cells Cancer Genetics Volume 205, Issue 3, March 2012, Pages 113–123  Xiaomin Danga, Aiqun Mab, Lan Yanga, Hao Huc, Bo Zhua, Dong Shanga, Tianjun Chena, Yu Luod
 
Notch3 regulates the activation of hepatic stellate cells[J]. World journal of gastroenterology: WJG, 2012, 18(12): 1397. Chen Y X, Weng Z H, Zhang S L.

订购须知

目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类:

1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具 

产品价格 本产品目录中标示的价格均为国内统一零售参考价,全部为人民币价格。如果大量定购时,在标准价格的基础上有不同程度的优惠。 

质量保证 凡吉玛公司的产品均有严格的质量保证。如果我们发现确实存在质量问题时,保证更换产品。如果在到货后一个月之内用户无提出异议,我们将视本产品为优良产品而不再受理投诉事宜。提出产品异议(或投诉)时,切莫在产品使用完(或快使用完)后提出,以备本公司回收产品,确认产品质量。由于订错产品而产生的退货情况,原则上由客户承担相关费用。发生投诉事宜时,公司只保证在产品价格额度范围之内酌情赔偿,恕不受理超过制品价格额度以上之部分。退款时需退还原始发票。

效果承诺

出货前标准品或含有基因样品或客户提供样本验证,其中一种方法可以检测出目的基因。如果基因验证不出来可以提供3对符合设计原则的引物各1nmol,正常付款结单或不出货不付款结单。

l 引物套装:如果客户做不出来,我们再次检测(客户可以提供样本),给客户提供检测报告确认后,重新给客户提供一次引物,如果客户还是做不出来,不再处理,客户货款正常支付。如我们验证也无效,可退票退款或做预付款。

l 引物探针套装:如果客户做不出来,我们再次检测(客户可以提供样本),给客户提供检测报告确认后,重新给客户提供一次引物,如果客户还是做不出来,不再处理,客户货款正常支付。如我们验证也无效,可退票退款或做预付款。

l 试剂盒:如果客户做不出来,我们再次检测(客户可以提供样本),给客户提供检测报告确认后,重新给客户提供一次引物,如果客户还是做不出来,不再处理,客户货款正常支付。如我们验证也无效,可退票退款或做预付款。


备注:

1. 以上无效需经过公司确认,如果验证符合公司出货标准,客户仍需支付相关费用。

2. 所有阳性或有效性确认,不同细胞表达调控不同,所以只需一种细胞或样品确认效果即可,不保证所有细胞或样品一定符合阳性结果。

3. 所有实验仅供科研使用。



下单前请务必核对订购表客户信息和订购内容无误,订单一经确认,当天即启动生产。 超过当日17:00后不能修改或者取消,如果需要取消订单,由此产生的费用,将由客户承担。

【取消订单费用规则】

(1)当日17:00前,免费修改或取消。

(2)当日17:00到次日17:00前,按该项产品金额的50%收取。

(3)次日17:00后,按该项产品金额的100%收取。


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