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miRNA荧光定量PCR试剂盒
Hairpin-it miRNAs RT-PCR Quantitation Kit的特点: 高度特异，特异性的Stem-loop RT primer与miR-specific Molecular Beacon probe双重保证，确保反应不受其前体及其他因素干扰；序列高度同源的miRNAs也可精确区分；
目前，最常用的检测和定量miRNA的方法是northern杂交, 芯片(microarrays)以及核糖核酸酶保护分析(ribonuclease protection assays)，这些传统方法都需要标记探针并与纯化的RNA进行杂交。由于成熟的miRNAs及其前体共享一段相同的靶序列，而目前基于杂交的各种技术又无法通过分子大小将它们区分，因此很难专一性的识别成熟miRNAs，结果导致很高的前体背景信号。
此外，基于杂交的各种技术需要标记步骤或放射性同位素，所得数据的动态分布范围又很有限，使得miRNAs的检测非常困难、费时且昂贵。
1 Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quatitation Assay 包括两步
1) Stem-loop RT
2) Real-time PCR
Stem-loop RT primer 与miRNA 分子的3’端结合，然后用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA;
将得到RT产物与miRNA特异引物以及荧光标记的Molecular Beacon probes一起进行优化的real-time PCR反应。
2 Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit 的特点
1) 高度特异，特异性的Stem-loop RT primer与miR-specific Molecular Beacon probe双重保证，确保反应不受其前体及其他因素干扰；序列高度同源的miRNAs也可精确区分；
2) 超宽的定量线性范围和高度检测灵敏度，从几个拷贝一直到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级；
3) 样品消耗量少，仅需1-10ng total RNA；
4) 适用的样品范围广，total RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可以用于qRT-PCR 的模板，即使基因组DNA的污染也不会干扰miRNA的定量；
5) 金牌质量的miRNA标准合成物，即可精确用来作标准曲线绝对定量之用，又可用来作相对定量的阳性对照
6) 操作快速简单，可实现RT与PCR反应一步完成；
7) 重复性好，经过吉玛公司经验丰富的技术人员严格的质量检验。
3 Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit 的产品订购信息
| Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit | ||
| 目录号 | 规格 | 价格 |
| E01006 | 50 rxns | ￥600 |
| E01007 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E01008 | 200rxns | ￥2,000 |
| E01009 | 300rxns | ￥2,500 |
| E01005 | 500 rxns | ￥3,600 |
4 Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit 的成分组成
ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,需要使用低浓度 ROX Reference Dye 校正的仪器有Applied Biosystems 7000/7300/7500/7500 Fast/7900 Real-Time PCR System，配套ROX 终浓度1×（0.4 µl）；需要使用高浓度ROX Reference Dye 校正的 仪器有Applied Biosys-tems Step One Plus Real-Time PCR System 和QuantStudio系列，配套ROX 终浓度为5×（2 µl）。其他品牌仪器不需要ROX校准，ROX Reference Dye需要避光保存。
5 Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit 的适用机型
适用的荧光定量PCR仪器ABI PRISM 7000/7300/7500/7900 MJ-opticon、Opticon2、Chromo4 及QuantStudio系列、MX3000p/4000 Bio-Rad IQ系列、Light Cycler、Rotogene3000、FTC-2000。
Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit提供的是利用实时荧光定量PCR对总 RNA中的miRNA检测与定量的一种方法，其不但灵敏而且极具特异性。miRNA 是由动物、植物和病毒基因组所编码的一种短小，单链，约有19-23个核苷 酸组成的RNA，成熟的miRNA参与组成“RNA诱导的沉默复合体”，并且指导该 复合体进行转录、转录后翻译的抑制或是特异性的内切靶mRNA。与一般的 miRNA检测方法不同，该Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit具有更快速，更灵敏的特点。
该试剂盒内有miRNA特异的逆转录引物，以及PCR正反向引物套装，并且 还带有荧光染料，茎-环结构样的miRNA特异逆转录引物以及高度特异的正反向引物使得逆转录和PCR反应避免了miRNA前体的干扰，而反应的模板可以是 总RNA或者细胞裂解物。
该体系提供了一种最低能检测到10个拷贝目标miRNA的高灵敏度的检测 方法，并且具有一个宽广的动态变化范围，能够实现从1μg总RNA中精确定 量检测高拷贝数的miRNA。
高度特异性 茎环结构的逆转录引物以及miRNA高特异的引物套装保证了 该方法的高度特异性，即使是高度同源的miRNA都能被准确区分。
荧光定量PCR比传统的miRNAs定量检测方法（如Northern blot和micro-array）具有更宽广的动态变化范围（至少7 次方的数量）和更高的灵敏度，保证了该方法能够准确定量0.1pg总RNA 中，最低量至7个拷贝的目标miRNA。更总RNA、细胞裂解物或是已纯化的miRNA分离物都可用于试剂盒反应所需的模板，甚至有基因组DNA的污染也不会干扰miRNA定量。
mmiRNA标准品能够用来制作标准曲线，当您想知道一个细胞中miRNA 的绝对数量时。如果您想得到miRNA和U6snRNA或者5S rRNA之间相对表达量之比，该标准品可起阳性对照的作用。
Hairpin-itTM miRNA定量分析包括两个步骤：茎环结构逆转录引物的逆转录反应和实时荧光定量PCR。茎环结构的逆转录引物能与miRNA的3’ 端的部分结合，在逆转录酶的作用下进行逆转录反应。然后特异的正反向引物和荧光染料共同参与的定量PCR反应体系，对上述逆转录产物进行 定量检测。
1 用户需要提供的材料
1) RNA 酶抑制剂(RNase inhibitor)
RNA酶抑制剂是从人胎盘中提取的一种广谱的核糖核酸酶抑制剂，分子量
约50KDa，在cDNA合成过程中可保护RNA不被RNA酶降解，提高cDNA质
量。
2) 良好光学PCR板或PCR管
为了消除在荧光检测的步骤中由于 PCR 管或是 PCR96 孔板所带来的误
差，我们推荐您使用与ABI PRISM 7000/7300/7500/7900, MX3000p/4000p 等
仪器配套的PCR管及96孔板。
2 miRNA检测试剂盒
实验数据：吉玛公司的miRNA检测试剂盒具有良好的线性动态范围和灵敏度：
Hairpin-itTMmiRNA 实时定量分析包括两步：茎环结构的逆转录反应和定量 PCR 检测。茎环结构的逆转录引物能与 miRNA 分子 的 3’端结合，并在逆转录酶的作用下进行反应，然后在高度特异的 正反向引物和荧光染料共同参与的定量 PCR 反应体系中，对上述逆转录产物定量检测。
为了获得目标miRNA相对管家基因（如U6 snRNA 或者 5S rRNA）的相对表达量，U6 snRNA或者 5S rRNA定量PCR校准试剂 盒是非常必要的，请参照该说明书第一页的“相关产品”。如果您 想获取更多信息，请登陆我们的网站：http://www.genepharma.com。
为了获得目标miRNA相对管家基因（如U6 snRNA 或者 5S rRNA）的相对表达量，U6 snRNA或者 5S rRNA定量PCR校准试剂 盒是非常必要的，请参照该说明书第一页的“相关产品”。如果您 想获取更多信息，请登陆我们的网站：http://www.genepharma.com。
miRNA 标准品的操作
吉玛提供的 miRNA 标准品是 1pmol 干粉的贮存形式，操作该标准品的时候请参照以下的技术指导：
稀释：把装有 RNA 标准品的管子于 10000 转/分钟离心一分钟。小心打开管盖，加入 1ml RNA dilution buffer（由试剂 盒提供）将此 RNA 标准品干粉稀释至 1nM，另拿一个 DEPC 处理过并灭菌过的 EP 管将 1nM 的贮存溶液稀释至 0.1nM 作 为工作浓度。然后再用同样处理的管子，把 0.1nM 的标准品 稀释液按照实验需要稀释成一系列的数量级（5~7 个）来制作标准曲线。
贮藏：将 1nM 的标准品溶液和 0.1nM 的工作液存放在–20
稀释：把装有 RNA 标准品的管子于 10000 转/分钟离心一分钟。小心打开管盖，加入 1ml RNA dilution buffer（由试剂 盒提供）将此 RNA 标准品干粉稀释至 1nM，另拿一个 DEPC 处理过并灭菌过的 EP 管将 1nM 的贮存溶液稀释至 0.1nM 作 为工作浓度。然后再用同样处理的管子，把 0.1nM 的标准品 稀释液按照实验需要稀释成一系列的数量级（5~7 个）来制作标准曲线。
贮藏：将 1nM 的标准品溶液和 0.1nM 的工作液存放在–20
℃是非常重要的，如能置于–70℃中，则保存时间会更长。无 RNA 酶环境：须事先注意的是:避免储存液被 RNA 酶 污染。
a. 所有的操作都推荐使用无 RNA 酶并高压灭菌过的移 液器及吸头。
b. 操作试剂时请戴上手套。
b. 操作试剂时请戴上手套。
miRNA 逆转录引物的操作
试剂盒中提供的逆转录引物是 10μM 的工作溶液，请根据每次
的实际用量将其稀释成 1μM 的 miRNA 逆转录引物溶液贮存于–20
℃。在一次标准的 miRNA 逆转录中，逆转录引物的终浓度为 60nM。
逆转录反应体系的制备
Hairpin-itTM miRNAs 定量分析所用的模板可以是总 RNA，细胞裂解产 物或是纯化后的微小 RNA。投入反应的 RNA 模板量可以根据实验的需要 从1μg 到3μg 或者更多。除了在 42℃反应比较稳定之外，对于逆转录 反应及逆转录酶并没有特殊的要求，我们推荐您用 20μl 逆转录体系。更多 的信息可以参阅你所使用的逆转录试剂的操作说明。
以下表格提供了一次 20μl 标准逆转录反应的体系（以Promega逆转录产品为例，货号：M1701）
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Component
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Final Con.
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Vol/1 rxns
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5×RT buffer
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1×
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4.00 μl
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dNTP（10 mM）
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0.375 mM
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0.75 μl
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U6 snRNA/ miRNA RT primers（1 μM）1
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60 nM
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1.20 μl
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MMLV Reverse Transcriptase（200 U/μl）
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40 U
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0.20 μl
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RNA Sample 2
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1-3 μg
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X μl
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RNase Free H2O
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To 20 μl 3
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1 可单独或混合逆转录miRNAs和U6；
2 RNA 模板量可以根据实验的需要从1 μg到3 μg或者更多。
3 除了在42℃反应比较稳定之外，对于逆转录反应及逆转录酶并没有特殊的要求，我们推荐您
用20μl 逆转录体系。
miRNA 逆转录程序
标准的逆转录反应程序：
26℃ 40 分钟，42℃ 40 分钟，85℃ 10 分钟，4℃保存。
（如客户自行提供逆转录试剂，反应条件须参考试剂供货说明书）
请把所有的试剂，反应的混合液和样品至于冰上。配置完成后，请将反应的混合液置于以 cDNA 合成的温度进行预热后的热循环仪上，立即开始逆转录反应。逆转录反应 85℃ 5 分钟结束后立即将 cDNA 产物取出， 快速置冰上冷却，后续所有步骤都在冰上进行，不要将 cDNA 产物随便从冰上移走。
miRNAs 实时定量 PCR 的操作程序
miRNA 逆转录产物的操作
混匀cDNA并且从中吸取2 μl（20 μl体系）当作定量PCR的模板。如果逆
转录引物工作液是U6 snRNA和miRNA的引物混合物，cDNA产物可作为U6
snRNA和miRNA荧光定量PCR反应的共同模板。逆转录cDNA暂时不用，可将
其存放于-20℃，三天内可保持稳定，长期保存请冻存于-80℃。
a. 按照下表分别配置miRNA和U6 snRNA 两个独立的荧光定量反应体系；
b. 建议客户在使用前混匀并低速离心,确保2× Real-time PCR Master Mix、50× ROX
Reference Dye、引物、模板完全溶解，所有的试剂都在管底或板孔底部。
c. 建议置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制:
| Component | Final Con. | Vol /1 rxns |
|
2× Real-time PCR Master Mix（SYBR）
|
1× | 10μl |
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miRNA/U6 snRNA specific Primer set（10μM）
|
0.2μM | 0.4μM |
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cDNA
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2μl | |
|
rTaq DNA polymerase（5 U/μl）
|
1U | 0.2μl |
|
RNase free H2O
|
To 20μl | |
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miRNAs 实时定量 PCR 反应程序
请您在您的定量PCR仪上设定如下程序：
95℃ for 3 minutes’ hold,
40 cycles of:
95℃, 12 seconds
62℃, 40 seconds
采集荧光信号应设在 62℃这一步。
建立一条标准曲线
试剂盒所提供的miRNAs标准品可以被添加到您从组织或是细胞中提取的
总RNA中当作miRNA对照。如果要知道一定量的RNA样品中miRNA具体的拷 贝数，我们推荐您可以按照以下步骤建立一条标准曲线。
1. 向RNA标准品中加入1ml的RNA dilution buffer到1nM的贮存浓度，准备另一个1.5mlEP管，把1nM的miRNA标准溶液稀释成0.1nM的工作浓度。把1nM miRNA标准储存液与引物和Master Mix分开存放于-70℃。
2. 将0.1nM的miRNA标准品用不含RNA酶的水稀释5~7个数量级。
3. 向20μl的逆转录体系中分别加入上述一系列稀释的RNA样品2μl。注意在逆 转录反应中每个浓度梯度应设置2~3个复孔。
4. 取4μl逆转录产物至40μl的定量PCR体系中。注意在PCR时每个浓度梯度也 应设置2~3个复孔。
5. 该标准曲线中，2μl 0.1nM 的RNA标准品加入至20μl逆转录体系中约代表 每个反应中包含6 ×107个拷贝。
1．如果是做多重反应，把所需的共同组分配成mix分装于管中或板孔中，再单
1．如果是做多重反应，把所需的共同组分配成mix分装于管中或板孔中，再单
独加反应所需的不同组分，所有操作务必在冰上进行。在做PCR反应时必须 严格的配制Mix来减少移液的误差。
2. 确保所有的试剂都在管底或板孔底部，必要的话可以短暂的离心。
质量控制
本产品用Hela细胞总RNA作为模板，用qRT-PCR进行了严格的测试，动态分析必
须表明在1pg的Hela细胞总RNA中，减少靶标的浓度和GAPDH和mRNA的量具有线 性的剂量效应。
Cui, W., Q. Li, et al. "MiR-126-3p regulates progesterone receptors and involves development and lactation of mouse mammary gland." Molecular and Cellular Biochemistry 355(1): 17-25.
Zhang, C., J. Zhang, et al. "High level of miR-221/222 confers increased cell invasion and poor prognosis in glioma." Journal of Translational Medicine 10(1): 119.
Li, H. M., C. M. Wang, et al. "MiR-15a Decreases Bovine Mammary Epithelial Cell Viability and Lactation and Regulates Growth Hormone Receptor Expression." Molecules 17(10): 12037-12048.
Chen, L., L. Han, et al. "VHL regulates the effects of miR-23b on glioma survival and invasion via suppression of HIF-1/VEGF and -catenin/Tcf-4 signaling." Neuro-Oncology 14(8): 1026-1036.
目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类：
1. RNA干扰研究工具
2. miRNA研究工具
产品价格 本产品目录中标示的价格均为国内统一零售参考价，全部为人民币价格。如果大量定购时，在标准价格的基础上有不同程度的优惠。
质量保证 凡吉玛公司的产品均有严格的质量保证。如果我们发现确实存在质量问题时，保证更换产品。如果在到货后一个月之内用户无提出异议，我们将视本产品为优良产品而不再受理投诉事宜。提出产品异议（或投诉）时，切莫在产品使用完（或快使用完）后提出，以备本公司回收产品，确认产品质量。由于订错产品而产生的退货情况，原则上由客户承担相关费用。发生投诉事宜时，公司只保证在产品价格额度范围之内酌情赔偿，恕不受理超过制品价格额度以上之部分。退款时需退还原始发票。
下单前请务必核对订购表客户信息和订购内容无误，订单一经确认，当天即启动生产。 超过当日17：00后不能修改或者取消，如果需要取消订单，由此产生的费用，将由客户承担。
【取消订单费用规则】
（1）当日17：00前，免费修改或取消。
（2）当日17：00到次日17：00前，按该项产品金额的50%收取。
（3）次日17：00后，按该项产品金额的100%收取。