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公司产品
mRNA荧光定量PCR试剂盒
吉玛提供的mRNA检测试剂盒为客户提供了一种便捷，准确的基因定量检测方法，吉玛公司为您精心设计的基因特异性引物，并且提供预优化的反应体系，检测特异性强，扩增效率高，为您提供相关基因研究提供了强有力的工具。
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Custom Real-Time PCR Gene Detection Assay |
目录号
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规格
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价格
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E021001
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50 rxns
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￥600
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E021002
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100 rxns
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￥1,100
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E021003
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200 rxns
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￥2,000
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E021004
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300rxns
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￥2,500
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E021005
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500 rxns
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￥3,600
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试剂盒组成（20μl 反应体系×100次） |
产品特点 |
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预先优化好的荧光定量PCR反应体系； 应用TaqMan荧光PCR基因检测技术； 实验操作简便，只需加入模板和Taq 酶即可； 用本试剂盒就可完成目标基因检测和表达定量研究； 轻松获得基因表达实验结果。 |
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服务特点 |
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免费设计引物和探针服务。 免费优化反应体系服务。 免费实验过程技术支持服务。 |
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| 试剂盒原理 | |
| 本试剂盒采用Displacement probe和TaqMan荧光PCR基因检测技术。原理请参阅请参阅A2、A4及F2页。 |
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GAPDH Gene Endogenous Control Kit |
目录号 | 规格 | 价格 |
| E03002 | 100 rxns | ￥1,000 | |
| E03003 | 200 rxns | ￥1,600 | |
| E03004 | 300rxns | ￥2,500 | |
| E03005 | 500 rxns | ￥3,800 |
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试剂盒组成（20μl 反应体系×100次） |
产品特点 |
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预先优化好的荧光定量PCR反应体系； 应用TaqMan荧光PCR基因检测技术检测样本中GAPDH基因； 实验操作简便，只需加入模板和Taq 酶即可。 可直接用于以GAPDH为内参照的基因表达定量研究 |
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适用的荧光定量PCR仪器 |
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ABI PRISM 7000/7300/7500/7900 MJ-opticon、Opticon2及Chromo4 系列 Bio-Rad IQ系列、Light Cycler、Rotogen 3000 X3000P/4000、FTC-2000 |
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β-actin Gene Endogenous Control Kit |
目录号 | 规格 | 价格 |
| E04002 | 100 rxns | ￥1,000 | |
| E04003 | 200 rxns | ￥1,600 | |
| E04004 | 300rxns | ￥2,500 | |
| E04005 | 500 rxns | ￥3,800 |
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试剂盒组成（20μl 反应体系×100次） |
产品特点 |
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预先优化好的荧光定量PCR反应体系； 应用TaqMan荧光PCR基因检测技术检测样本中的β-actin基因； 实验操作简便，只需加入模板和Taq 酶即可。 可直接用于以β-actin为内参照的基因表达定量研究。 |
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适用的荧光定量PCR仪器 |
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ABI PRISM 7000/7300/7500/7900 MJ-opticon、Opticon2及Chromo4 系列 Bio-Rad IQ系列、Light Cycler、Rotogen 3000 MX3000P/4000、FTC-2000 |
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| 目录号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
| E05001 | B2M (beta-2-microglobulin) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E05002 | B2M (beta-2-microglobulin) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E05003 | B2M (beta-2-microglobulin) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E05004 | B2M (beta-2-microglobulin) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E06001 | GUSB (beta glucuronidase) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E06002 | GUSB (beta glucuronidase) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E06003 | GUSB (beta glucuronidase) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E06004 | GUSB (beta glucuronidase) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E07001 | HPRT1 (HGPRT) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E07002 | HPRT1 (HGPRT) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E07003 | HPRT1 (HGPRT) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E07004 | HPRT1 (HGPRT) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E08001 | PGK1(phosphoglycerate kinase 1) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E08002 | PGK1(phosphoglycerate kinase 1) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E08003 | PGK1(phosphoglycerate kinase 1) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E08004 | PGK1(phosphoglycerate kinase 1) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E09001 | PPIA(cyclophilin) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E09002 | PPIA(cyclophilin) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E09003 | PPIA(cyclophilin) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E09004 | PPIA(cyclophilin) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E10001 | RPLP0(large ribosomal protein) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E10002 | RPLP0(large ribosomal protein) 对照试剂盒 | 100 rxns |
￥1,100 |
| E10003 | RPLP0(large ribosomal protein) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E10004 | RPLP0(large ribosomal protein) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E11001 | TBP(TATA-box binding protein) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E11002 | TBP(TATA-box binding protein) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E11003 | TBP(TATA-box binding protein) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E11004 | TBP(TATA-box binding protein) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E12001 | TFRC(CD71)(transferrin receptor) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E12002 | TFRC(CD71)(transferrin receptor) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E12003 | TFRC(CD71)(transferrin receptor) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E12004 | TFRC(CD71)(transferrin receptor) 对照试剂盒 |
300 rxns |
￥2,500 |
| E13001 | Mouse ACTB(actin, beta) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E13002 | Mouse ACTB(actin, beta) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E13003 | Mouse ACTB(actin, beta) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E13004 | Mouse ACTB(actin, beta) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E14001 | Mouse GAPDH 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥6000 |
| E14002 | Mouse GAPDH 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E14003 | Mouse GAPDH 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E14004 | Mouse GAPDH 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E15001 | Rat ACTB(actin, beta) 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E15002 | Rat ACTB(actin, beta) 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E15003 | Rat ACTB(actin, beta) 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E15004 | Rat ACTB(actin, beta) 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
| E16001 | Rat GAPDH 对照试剂盒 | 50 rxns | ￥600 |
| E16002 | Rat GAPDH 对照试剂盒 | 100 rxns | ￥1,100 |
| E16003 | Rat GAPDH 对照试剂盒 | 200 rxns | ￥2,000 |
| E16004 | Rat GAPDH 对照试剂盒 | 300 rxns | ￥2,500 |
其他基因表达及管家基因内参照试剂盒定制流程
*注：如客户不以来电或Email形式确认地址、电话等相关联系信息，GenePharma将视此次定制申请为无效申请。
吉玛提供的mRNA检测试剂盒为客户提供了一种便捷，准确的基因定量检测方法，吉玛公司为您精心设计的基因特异性引物，并且提供预优化的反应体系，检测特异性强，扩增效率高，为您提供相关基因研究提供了强有力的工具。
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试剂盒组成（20μl 反应体系×100次） 试剂保存 -20℃保存，避免反复冻融。保质期3个月。
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产品特点 |
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1、预先优化好的荧光定量PCR反应体系； 2、经实验室验证，适用于多种类型的荧光探针和染料； 3、适用于多种不同体积反应体系。 4、使用方便，只需加入酶、模板、探针/染料即可进行定量PCR反应. |
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适用的荧光定量PCR仪器 |
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2、MJ-opticon、Opticon2及Chromo4 系列 3、Bio-Rad IQ系列、Light Cycler、Rotogen 3000 4、MX3000P/4000、FTC-2000 |
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| 使用方法 | |
| Real-time PCR Master Mix的浓度为2×，使用时按5μl/10μl反应体系加入；在加入酶、模板、探针/染料后用水补足至所需体积后即可进行Real-time PCR反应 |
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产品说明 Ezol 试剂是用于总RNA 抽提的试剂，适用于人类、动物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA提取。样本经 Ezol 充分裂解后加入氯仿离心，形成上清层、中间层和有机层， 收集上清层用异丙醇沉淀RNA。Ezol试剂操作简便易行，可以同时处理多个样品，并得到高质量的RNA 。纯化的RNA可以直接用于RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA 酶保护分析、RT-PCR 分析、构建 cDNA 文库等 RNA 研究。 □产品特点 1、可获得高纯度、高产率的 RNA。 2、适用于多种细胞或组织总RNA的提取 3、无论是小量的细胞（5×106）或组织（50-100mg）还是大量的细胞（107）或组织（>1g）都可得到出色的结果。 4、操作简便，可实现RNA的快速抽提。 □试剂保存 室温或2-8℃避光保存，保质期12个月。 |
PROTOCOL |
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20毫克组织或106-107个细胞/ml Ezol 混匀后室温搁置15min 按200ul氯仿/ml Ezol加入氯仿，振荡混匀，冰上放置10分钟 4℃ 12,000 rpm 15min 取上层水相移入0.5 ml EP 管内，加入等体积预冷的异丙醇 颠倒混匀，室温搁置10～15分钟 4℃ 12,000 rpm 10min， 轻倒上清，吸水纸上沾干， 按1ml乙醇/ml抽提液加入75％冰乙醇轻旋颠倒洗涤 4℃ 12,000 rpm 5min 轻倒上清，吸水纸上倒扣沾干，适度干燥 DEPC H2O或TE溶液溶解RNA 28S RNA 18S RNA  图 RNA电泳图 |
| Trouble Shooting of Ezol Total RNA Extraction Reagent | ||
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问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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抽提的RNA有降解 |
动植物体组织取下后未立即进行抽提或冰冻保存 |
采用新鲜组织，在研磨过程中不断加入液氮保持组织的生物活性 |
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溶液、试管等用具有RNase 污染 |
所有与RNA 抽取相关的器具均须做RNase 去除处理 |
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抽提过程中没有戴手套或者没有勤换手套；抽提过程中未注意避免说话,造成唾沫中RNA 酶污染 |
操作过程中要佩戴手套和口罩 |
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RNA 存放的温度较高 |
RNA长期储存请置于-80℃冰箱 |
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RNA得率 |
样品匀浆或裂解不完全 |
适当延长裂解时间,使样品充分裂解 |
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RNA 未完全溶解 |
避免过度干燥并延长RNA溶解时间 |
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未选用RNA 含量丰富的新生、生长旺盛的组织或细胞 |
选择较新鲜的,生长旺盛的样品 |
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离心机转速和离心力不能达到要求 |
加大转速或延长离心时间 |
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抽提的RNA有DNA 污染 |
样品匀浆后加入的Ezol量过少 |
在建议用量基础上减少组织量或加大Ezol使用量，或用DNase I处理 |
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将中间层吸入 |
吸取上清时尽量小心操作 |
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加入氯仿前,样本没有在室温下放置15分钟; |
保证样品充分裂解；在环境温度较低的情况下，可适度延长放置时间 |
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加入氯仿后,振荡过于剧烈 |
轻柔振荡 |
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样品量过多 |
在建议用量基础上减少组织量或加大Ezol 使用量，或用DNase I处理 |
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OD260/OD280比率偏低(<1.65) |
在分光光度计测量前用不适当的溶液稀释RNA样品,低离子强度和低pH溶液会增加280 nm的光吸收值 |
采用TE 或Tris-HCl溶解样品,检测OD 值 |
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匀浆后样品所加的Ezol用量偏少 |
在建议用量基础上减少组织量或加大Ezol 使用量 |
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结果
结论
电泳结果显示产物大小正确，无杂带说明无非特异性扩增；
电泳结果显示产物大小正确，无杂带说明无非特异性扩增；
电泳结果的阴性对照显示没有目的带，说体系没有污染。
相对定量计算释
相对定量计算释
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样品
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内参基因
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目标基因
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重复1
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8.59
|
22.35
|
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重复2
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8.85
|
22.50
|
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重复3
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9.10
|
22.58
|
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平均 CT
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8.85±0.26
|
22.48±0.12
|
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DCT
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—
|
13.63±0.28
|
1. “平均 CT” 表示三个重复Ct的平均值 ， “±”后面的数字表示三个重复Ct的标准偏差standard deviation (SD) ，SD计算公式如下
2. DCT 表示同一个样品目标基因和内参基因平均Ct值的差值，计算如下:
microRNA/gene DCT＝目标平均CT- 内参平均 CT=22.48-8.85=13.63
3. DDCT 表示特定目标基因的待检样品和校准样品DCt的差值 样品and test 样品，计算如下:
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待检 样品
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校准 样品
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内参基因
|
目标基因
|
内参基因
|
目标基因
|
|
|
重复1
|
8.59
|
22.35
|
8.50
|
21.92
|
|
重复2
|
8.85
|
22.50
|
8.72
|
22.09
|
|
重复3
|
9.10
|
22.58
|
9.00
|
22.37
|
|
Mean CT
|
8.85±0.26
|
22.48±0.12
|
8.74±0.25
|
22.13±0.23
|
|
DCT
|
—
|
13.63±0.28
|
—
|
13.39±0.34
|
|
DDCT
|
—
|
0.24±0.44
|
—
|
0.00±0.48
|
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2-DDCT
|
—
|
0.85(0.62~1.15)
|
—
|
1.00(0.72~1.39)
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注意: DDCT计算时， “±”后面的数值 of 我们定义为 S4,S4=Sqr（S32+S02）.在此公式中”S3表示待检样品 DCT 的SD值， “S0表示校准样品 DCT 的SD值.
4. 最后, 2-DDCT 和括号里的数值都来源于DDCT 值，红色标记表示相对校准样品表达量低，相反蓝色标记表示相对校准表达量高。
【试剂盒简介】
mRNA基因检测试剂盒是一款基于荧光定量PCR平台所开发，用于特异检测mRNA基因表达水平的试剂盒。
【原理】
Sybr Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，Sybr Green I只与双链DNA结合才能发出荧光，而不掺入链中的Sybr染料分子不会发射任何荧光信号，荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加，荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。以Sybr Green I作为检测信号的荧光定量PCR方法称为染料法。
mRNA定量分析包括两个步骤：特异性或随机引物N6的逆转录反应和实时荧光定量PCR。对于逆转录反应这一过程而言，当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板。而特异性引物是目标RNA的互补序列，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始，用特异性引物仅产生所需要的cDNA，使后续的PCR扩增更为特异。吉玛采用特异性引物来进行逆转录反应。
荧光定量PCR分析
1) 引物设计
2）仪器与设备
实时荧光定量通用试剂(Cat# GMRS-001吉玛, 上海)
FTC3000 实时荧光定量PCR仪 (枫岭)
a.总RNA提取
1. 将细胞用预冷PBS缓冲液洗2遍，加1ml Ezol 裂解液重悬。
2. 加入0.2ml三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置3分钟。
3. 4℃，12,000 x g离心20min。
4. 将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的100%乙醇。
5. 吸取全部样品，加入带有2ml收集管的mini-spin离心柱。8,000 x g，室温离心15 s，弃尽流穿液。
6. 将剩余的样品转移至离心柱，重复第6步。
7. 往离心柱中加入700μl WB，轻盖盖子， 8,000 x g，室温离心15 s，弃尽流穿液。
8. 重复第8步，用500μl WB洗涤离心柱三次。
9. 将离心柱转移至一新的无RNA酶的1.5ml离心管中，往硅胶膜中央滴加50μl DEPC水，4℃，10,000 x g离心3min洗脱RNA。
【实验体系】
b.mRNA 逆转录反应体系
*注意：使用前请将RT Primer稀释成1μM。
|
Component |
Final Con. |
Vol/rxn |
|
RNA 模板 |
1-3μg |
2μl |
|
Random N6（100μM）/ Gene Specific RT Primer（1μM） |
25μM/60nM |
5μl/1.2μl |
70℃ 5min 加入下述反应体系
|
Component |
Final Con. |
Vol/rxn |
|
5×RT buffer |
1× |
4μl |
|
dNTP(10mM) |
0.375mM |
0.75μl |
|
MMLV Reverse Transctiptase (200U/μl) |
0.5 U/μl |
0.25μl |
|
RNase Free H2O |
|
To 13μl / 16.8μl |
42℃，45min; 85℃，5min; 4℃保存。
*注意：如果需要在同一管体系内同时检测目的基因和内参基因，则只需加入相同终浓度的内参基因RT引物量，把多余的水的体积扣除即可。PCR反应时必须分管做。
c.mRNA 实时荧光定量反应体系
|
Component |
Final Con. |
Vol/rxn |
|
2× Real-time PCR Master Mix |
1× |
10μl |
|
Gene specific Primer set (10uM) |
0.2μM |
0.4μl |
|
ROX referrence (50×) |
1×/5× |
0.4μl/2μl |
|
cDNA |
— |
2μl |
|
Taq DNA ploymerase (5U/μl) |
1U |
0.2μl |
|
RNase Free H2O |
|
To 20μl |
d.定量PCR反应程序
反应程序：
95℃ 3min；40cycles of 95℃ 12s, 62℃ 40s；
62℃时采集信号，选择SYBR Green或者FAM通道。
1.Zhou Z, Wan J, Hou X, Geng J, Li X, Bai X. MicroRNA-27a promotes podocyte injury via PPARγ-mediated β-catenin activation in diabetic nephropathy. Cell death & disease. 2017 Mar; 8(3): e2658.
2.Zhong C, Feng J, Lin X, Bao Q. continuous release of bone morphogenetic protein-2 through nano-graphene oxide-based delivery influences the activation of the NF-κB signal transduction pathway. International Journal of Nanomedicine. 2017 Feb; 12: 1215-26.
3.Xu W, Zhang Z, Zou K, Cheng Y, Yang M, Chen H, Wang H, Zhao J, Chen P, He L, Chen X, Geng L, Gong S. MiR-1 suppresses tumor cell proliferation in colorectal cancer by inhibition of Smad3-mediated tumor glycolysis. Cell Death & Disease. 2017 May; 8(5): e2761.
4.Xiong Y, Shi L, Wang L, Zhou Z, Wang C, Lin Y, Luo D, Qiu J, Chen D. Activation of sirtuin 1 by catalpol-induced down-regulation of microRNA-132 attenuates endoplasmic reticulum stress in colitis. Pharmacological Research. 2017 Sep; 123: 73-82.
5.Chen YF, Wang SY, Yang YH, Zheng J, Liu T, Wang L. Targeting HSF1 leads to an antitumor effect in human epithelial ovarian cancer. International Journal of Molecular Medicine. 2017 Jun; 39(6): 1564-70.
6.Chu M, Zhao Y, Feng Y, Zhang H, Liu J, Cheng M, Li L, Shen W, Cao H, Li Q, Min L. MicroRNA-126 participates in lipid metabolism in mammary epithelial cells. Molecular and Cellular Endocrinology. 2017 Oct 15; 454: 77-86.
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9.Zhao K, Wang L, Li T, Zhu M, Zhang C, Chen L, Zhao P, Zhou H, Yu S, Yang X. The role of miR-451 in the switching between proliferation and migration in malignant glioma cells: AMPK signaling, mTOR modulation and Rac1 activation required. International Journal of Oncology. 2017 Jun; 50(6): 1989-99.
10.Ding Y, Zhang C, Zhang J, Zhang N, Li T, Fang J, Zhang Y, Zou F, Tao Z, Tang S, Zhu W, Chen H, Sun X. miR-145 inhibits proliferation and migration of breast cancer cells by directly or indirectly regulating TGF-β1 expression. International Journal of Oncology. 2017 May; 50(5): 1701-10.
目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类：
1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具
产品价格 本产品目录中标示的价格均为国内统一零售参考价，全部为人民币价格。如果大量定购时，在标准价格的基础上有不同程度的优惠。
质量保证 凡上海吉玛制药技术有限公司的产品均有严格的质量保证。如果我们发现确实存在质量问题时，保证更换产品。如果在到货后一个月之内用户无提出异议，我们将视本产品为优良产品而不再受理投诉事宜。提出产品异议（或投诉）时，切莫在产品使用完（或快使用完）后提出，以备本公司回收产品，确认产品质量。由于订错产品而产生的退货情况，原则上由客户承担相关费用。发生投诉事宜时，公司只保证在产品价格额度范围之内酌情赔偿，恕不受理超过制品价格额度以上之部分。退款时需退还原始发票。
针对circRNA检测qPCR引物，鉴于不同细胞，不同circ序列等表达丰度有差异，有的甚至非常低或序列本身不是很确切，所以我们针对目的基因设计3对引物验证。如果客户检测无效且已付款，我们可以免费重新设计3对验证一次。如果再次无效则不再免费重做。目前我们成功率大约在80%左右（根据扩增产物大小电泳或熔解曲线判断，如需进步对扩增产物测序鉴定费用另计：一对引物一个样品验证费用1500元，预付50%启动实验，无效只收预付款）。
对于circRNA产品线，目前不保证100%一定成功。
下单前请务必核对订购表客户信息和订购内容无误，订单一经确认，当天即启动生产。 超过当日17：00后不能修改或者取消，如果需要取消订单，由此产生的费用，将由客户承担。
【取消订单费用规则】
（1）当日17：00前，免费修改或取消。
（2）当日17：00到次日17：00前，按该项产品金额的50%收取。
（3）次日17：00后，按该项产品金额的100%收取。