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RNAi对照
吉玛可以提供阴性和阳性siRNA对照
阴性对照: 通用对照(NC),固定序列,与人,大鼠,小鼠转录组比对无同源性。
定制序列对照(scramble NC): 根据客户提供siRNA序列打乱,与转录组比对无同源性。
阳性对照(部分基因):GAPDH,b-actin,GFP等
A. 阴性对照 |
|
吉玛可提供与目的基因序列无同源性的通用阴性对照和将选中的siRNA序列打乱(scrambled)的阴性对照 | 1. siRNA实验应该有阴性对照; |
2. 通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照; | |
3. Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性; | |
4. 阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因没有同源性。 |
B. 荧光标记(FAM)的阴性对照 | |
吉玛可提供与目的基因序列无同源性的FAM标记的通用阴性对照 | 1. 通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照; |
2. 通过标记荧光,可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况; | |
3. 可用于优化转染条件和评价转染效率; | |
4. 具备很好的pH耐受性,在活细胞中更稳定。 |
目录号 |
产品名称 |
规格 |
纯化方式 |
价格 |
交货期限 |
A06001 |
阴性对照siRNA |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2个工作日 |
A07001 |
FAM标记阴性对照siRNA |
1 OD |
HPLC |
¥150 |
2个工作日 |
C. 阳性对照 |
吉玛公司可提供的常用的siRNA阳性对照 |
阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说,当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时,您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的 |
1. GFP-274 |
2. Luciferase GL2 |
|
3. GAPDH(human/mouse/rat) |
|
4. β-actin (human/mouse/rat) |
|
5. P53 |
|
6. lamin A/C |
目录号 |
产品名称 |
规格 |
纯化方式 |
价格 |
交货期限 |
A08001 |
阳性对照siRNA, LaminA/C |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4个工作日 |
A08002 |
阳性对照siRNA, GFP274 |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2个工作日 |
A08003 |
阳性对照siRNA, Luciferase GL2 |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4个工作日 |
A08004 |
阳性对照siRNA, MAPK1 |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4个工作日 |
A08005 |
阳性对照siRNA, Beta-Actin |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2个工作日 |
A08006 |
阳性对照siRNA, Vimentin |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4个工作日 |
A08007 |
阳性对照siRNA, P53 |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2个工作日 |
A08008 |
阳性对照siRNA, GAPDH |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
2个工作日 |
A08009 |
阳性对照siRNA, Cyclophilin B |
1 OD |
HPLC |
¥120 |
4个工作日 |
D. 转染试剂对照 |
对于一个完善的对照系统,转染试剂对照(Mock transfection )是不可缺的。转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响。 |
我们推荐使用我们公司最新的GenePharma转染试剂 。(见转染试剂)
目录号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
交货期限 |
G04001 |
RNAi-Mate转染试剂 |
0.1ml |
¥150 |
2个工作日 |
G04002 |
siRNA-Mate转染试剂 |
0.1ml |
¥150 |
2个工作日 |
G04003 |
siRNA-Mate转染试剂 |
1ml |
¥1,500 |
2个工作日 |
G04008 |
GP-transfect-Mate |
0.1ml |
¥150 |
2个工作日 |
G04009 |
GP-transfect-Mate |
1ml |
¥1,500 |
2个工作日 |
E. 避免脱靶效应对照 |
对于RNAi研究来说,在哺乳动物中,脱靶效应是一个十分关注的问题。有大量的报道,一个siRNA影响多个基因的表达。因此,大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验,然后分析各自对基因表达效果的影响。理想的结果是针对不同区域的siRNA对同一个靶基因产生相似的干扰效果。吉玛公司的技术人员为您针对同一个靶基因设计多对siRNA oligos,为您解决脱靶效应的难题。 |
注: NC序列是大量文献引用的一段序列,和所有的哺乳动物都没有同源性,适用于大鼠、小鼠、人等不同基因的研究。
FAM-siRNA 对照产品的溶解及保存
1.1 由于OligoRNA很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开离心管前先离心,然后再慢慢打开管盖,溶解时加适量DEPC水后盖上管盖,振荡溶解。
1.2 1OD≈33ug≈2.5nmol为了得到20uM的浓度,应该使用125ul附送的DEPC水去重悬1OD的siRNA,溶解后为20uM的样品。
1.3 贮存和稳定性:-20℃,荧光标记产品需要避光保存。液体(贮存浓度为20μM)溶解后分装,避免反复冻融,3个月内用完;-20或者-80保存下siRNA oligo 干粉的稳定性可达到6个月,使用的管子、枪头要无酶处理。
荧光标记的siRNA
转染效率的高低可以通过荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)实现。
FAM-siRNA 转染细胞后,可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测,确定是否有效转染和优化转染条件。FAM-siRNA 还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
图1. FAM-NC转染细胞后的荧光
图2. CY3-NC转染细胞后的荧光图
图3. 以B为校准hACTB为内参hGAPDH基因表达水平
A.siRNA转染的方法
哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面:转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时的细胞密度、转染时的操作顺序、细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间
GP-transfect-Mate 操作流程(24 孔板)
以24 孔板为例,若要检测基因沉默或者过表达效果,推荐最低RNA oligo终浓度为50nM
(DNA为0.5~1.5μg);遵循以下操作方法可以高效地将RNA oligo或者DNA转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。但是对某些特殊的细胞系和培养条件,或特殊应用等,也需要单独特别优化,请参考表 1、表2。
1. 细胞铺板
转染时细胞密度:一般来说,当细胞密度达到60%~80%时进行转染可以取得较高的转染效率(参见表1)。然而,不同细胞的最适转染密度都不尽相同,因此在初次转染某种细胞时,可以通过预实验先确认该细胞最佳的转染密度。
2. 转染复合物的制备
(1)将 GP-transfect-Mate转染试剂放置于室温中,使用前轻轻混匀。
(2)在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM,并添加适量的转染试剂(参见表2),用移液器轻轻混匀,室温静置5 min。
(3)同时在另一1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM,并添加适量的RNA oligo/DNA (参见表2),用移液器轻轻混匀,室温静置5 min。
(4)将GP-transfect-Mate-培养基混合物滴加至RNA oligo/DNA-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀,室温静置15-20 min 后,立即转染。
注:复合物尽量在60 min内使用,并且GP-transfect-Mate-培养基混合物和RNA oligo/DNA-培养基混合物的混合次序非常重要,切勿颠倒。
3. 转染过程
(1)趁静置时,给 24 孔板换液,每孔换上 0.4ml 预热的新鲜培养基。
(2)将 100 µl 转染混合物加入孔中,终体系为500 µl。加完后将板轻轻晃动以使复合物均匀分布。
(3)37℃静置培养细胞,4-6h换成完全培养基。24-72 h检测mRNA表达,48-96 h检测蛋白表达。
适用范围
293T, A549, Beas-2B,HeLa,ECA-109,Raw264.7,A375,CAFs,HCT116,HT29,LMH,NE-4C,MGC803,PC-3, PC-12,MCF-7,C6等细胞。
表 1: 贴壁细胞或悬浮细胞接种数量、培养基体积
培养器皿
每孔表面积(cm2)
每孔培养基的体积(ml)
贴壁细胞转染前一天接种密度
悬浮细胞转染当天接种密度
96 孔板
0.3
0.1
5 000±2 500
2-5×104
24 孔板
2
0.5
25000±10 000
1-2.5×105
12 孔板
4
1
50000±20 000
2-5×105
6 孔板
10
2
150000±50 000
0.4-1×106
60mm
20
4
400000±100 000
1-2.5×106
100mm
60
10
1*106±250 000
2-5×106
注:贴壁细胞培养密度取决于培养器皿的表面积,而悬浮细胞则由培养基的体积决定。
表 2 不同培养板转染DNA/RNA oligo的推荐转染条件
培养器皿 |
Growth Medium |
Opti-MEM/ Serum-free Mediumfor complex |
DNA 转染 |
RNA转染 |
||
DNA/μg |
转染试剂/μl |
RNA/pmol |
转染试剂/μl |
|||
96 孔板 |
100 μl |
2×10μl |
0.2 |
0.4-1 |
20 |
0.5-1 |
24 孔板 |
500 μl |
2×50μl |
0.6 |
1.2-3 |
40 |
1-3 |
12 孔板 |
1ml |
2×100μl |
1.5 |
3-6 |
80 |
3-5 |
6 孔板 |
2 ml |
2×200 μl |
3 |
6-12.5 |
150 |
5-8 |
60mm |
5ml |
2×500 μl |
6-10 |
12-20 |
300 |
10-20 |
100mm |
10 ml |
2×1ml |
15-30 |
30-60 |
500 |
25-35 |
注:GP-transfect-Mate转染试剂的用量在此范围内进行优化。
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目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类:
1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具
产品价格 本产品目录中标示的价格均为国内统一零售参考价,全部为人民币价格。如果大量定购时,在标准价格的基础上有不同程度的优惠。
质量保证 凡吉玛公司的产品均有严格的质量保证。如果我们发现确实存在质量问题时,保证更换产品。如果在到货后一个月之内用户无提出异议,我们将视本产品为优良产品而不再受理投诉事宜。提出产品异议(或投诉)时,切莫在产品使用完(或快使用完)后提出,以备本公司回收产品,确认产品质量。由于订错产品而产生的退货情况,原则上由客户承担相关费用。发生投诉事宜时,公司只保证在产品价格额度范围之内酌情赔偿,恕不受理超过制品价格额度以上之部分。退款时需退还原始发票。
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(1)当日17:00前,免费修改或取消。
(2)当日17:00到次日17:00前,按该项产品金额的50%收取。
(3)次日17:00后,按该项产品金额的100%收取。
GPL4-RL | |
LV3(H1/GFP&Puro) | |
LV3(H1/GFP&Puro) |