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特殊化学修饰siRNA
RNAi技术的最大难题就是化学合成siRNA稳定性问题。GenePharma化学修饰stableTMsiRNA作用时间长，比标准的siRNA的作用时间延长一倍左右。GenePharma化学修饰stableTMsiRNA不仅增强了在血清和细胞培养中的寿命，而且加强了在离体条件下的应用能力。
RNAi技术的最大难题就是化学合成siRNA稳定性问题。GenePharma化学修饰stableTMsiRNA最大的目标就是一次性获得最佳的实验数据。我们的方法就是使用RNAi－Mate转染试剂将化学修饰stableTMsiRNA导入哺乳动物细胞中，获得如下满意结果：
1、高效的基因沉默
2、高稳定性—在血清和培养基中
3、最大限度减少副作用
4、更长的作用时间
化学修饰stableTMsiRNA oligo与普通的siRNA oligo性能对照表
| 关键难题 | 标准的siRNA | 化学修饰stableTMsiRNA |
| siRNA 降解 | 标准的非修饰的siRNA在细胞培养过程中很容易降解，虽然在大部分的离体实验中是有效的，但是在细胞培养中寿命较短。 | GenePharma化学修饰stableTMsiRNA不仅增强了在血清和细胞培养中的寿命，而且加强了在离体条件下的应用能力。 |
| 作用时效 | 作用时间较短，一般情况下为1-3天。 | GenePharma化学修饰stableTMsiRNA作用时间长，比标准的siRNA的作用时间延长一倍左右。 |
| 活体应用的活性 | 标准的siRNA稳定性较差，一般不适用于体内试验。 | GenePharma化学修饰stableTMsiRNA在体内的稳定性强。 |
GenePharma 提供的siRNA 修饰方式
吉玛提供高纯度的siRNA。可提供选择的标记和修饰方式包括如下：
注：价格只是修饰费用，不包括RNA合成费用，oligo规格为OD数，价格单位为人民币：元.
| 5'端修饰 | 纯化方式 | 规格 | 价格 |
| Thiol | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| biotin | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| biotin-teg | HPLC | 5 OD以内 | 400 |
| chol | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| HEX | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| TET | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| FAM | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| CY3 | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| CY5 | HPLC | 5 OD以内 | 500 |
| C6-NH2-TFA | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| C6-NH2-MMT | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| C6-NH2-PDA | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| TAMRA | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| PHOS | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| Hexynl | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| CFR610 | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| 3'端修饰 | 纯化方式 | 规格 | 价格 |
| C7-NH2 | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| chol | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| BHQ-1 | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| BHQ-2 | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| DABCYL | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| FAM | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| CY3 | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| CY5 | HPLC | 5 OD以内 | 500 |
| Thiol | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| TAMRA | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| biotin | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| biotin-teg | HPLC | 5 OD以内 | 400 |
| ddC | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| GALNAC | HPLC | 5 OD以内 | 500 |
| PHOS | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| MGB | HPLC | 5 OD以内 | 400 |
| CFR610 | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| 中间体修饰(CEPA类) | 纯化方式 | 规格 | 价格 |
| spacer 18(PEG) | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| spacer 9 | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| SE(锁核酸） | HPLC | 5 OD以内 | 300 |
| 2'-ome | HPLC | 5 OD以内 | 100 |
| 2'-F | HPLC | 5 OD以内 | 100 |
| rI | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| dI | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| 5-Me-dC | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| 4’-Thiol-dU CEPA | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| idT-CEPA | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| 2'-MOE | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| Gemcitabine | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| Spacer C3 | HPLC | 5 OD以内 | 200 |
| 序列修饰 | 纯化方式 | 规格 | 价格 |
| ASO修饰 | HPLC | 5 OD以内 | 询价 |
| ESC修饰 | HPLC | 5 OD以内 | 询价 |
| PS修饰 | HPLC | 5 OD以内 | 询价 |
本公司提供的siRNA相关产品直接作用于靶基因mRNA，因此我们建议您在收到我们的相关产品后先进行实时定量PCR检测，以确定靶基因mRNA表达水平的变化，进而直接确认我们合成或构建的siRNA产品是否有效。
RNAi活体研究（In vivo RNAi）
在培养的哺乳动物细胞中，RNA干扰已经广泛应用于基因功能的研究。虽然RNAi干扰已经在体外（in vitro）研究中成为一个强大的研究方法，但是我们还是要着眼于将基因功能的研究放在整体生物中进行评价。为此，研究人员现在应用RNAi活体研究（RNAi in vivo）的方法来进行研究。虽然此项研究还处于早期，但是活体RNAi用已经越来越广使用并取得了不少进展。目前在活体研究中的两个基本方法：
1. 化学合成的siRNA
2. 质粒或者病毒载体的方法
化学合成方法容易合成，成本低，转染效率高，目前已经广泛应用于活体研究，质粒和病毒相对而言难于构建合成，并且经常有突变，转染效率低，有免疫原性等缺点。在活体水平，siRNA成功调控基因的成麽主要依赖于有效的传递方式，特异靶组织的siRNA富集浓度，siRNA的稳定性。目前已经有多报道应用局部注射或者全身性给药的方式，siRNA成功抑制基因表达。
吉玛化学修饰的stableTM siRNA已经成功应用于活体研究。
吉玛提供多种修饰方式的siRNA满足客户活体水平基因功能研究。我们的单体的修饰方式有2’-F, 2’-Ome，磷酸化修饰，胆固醇修饰，巯基修饰等。我们in vivo siRNA经过离子交换式的HPLC纯化，纯度>95%以上。
| 目录号 | 产品说明 | 规格 | 纯化方式 | 价格 | 交货期限 |
| A02004 | Chemically modified siRNA | 4 OD | HPLC | ￥600 | 6个工作日 |
| A02005 | Chemically modified siRNA | 5 OD | HPLC | ￥700 | 6个工作日 |
| A02010 | Chemically modified siRNA | 10OD | HPLC | ￥1300 | 6个工作日 |
| A02025 | Chemically modified siRNA | 25OD | HPLC | 询价 |
询问 |
| A02050 | Chemically modified siRNA | 50OD | HPLC | ￥5000 | 6个工作日 |
| A02100 | Chemically modified siRNA | 100OD | HPLC | ￥6500 | 8个工作日 |
| A02250 | Chemically modified siRNA | 250OD | HPLC |
询价 |
询问 |
siRNA Real-Time PCR结果分析
对于RNAi实验而言，我们通常需要知道的是某一特定细胞在导入siRNA前后某一特定基因的表达变化情况来判断siRNA起到了Gene Knockdown作用。应用荧光定量PCR的方法，可以通过两种途径来实现上述判断，一是测定特定细胞在导入siRNA前后某一特定基因mRNA数量的变化，即为绝对定量；二是通过检测特定基因与某一管家基因在在导入siRNA前后相对表达情况的变化，即为相对定量。通常采用相对定量的方法来检测siRNA的Gene Knockdown作用。
1．Real-Time PCR 实验设计
Real-Time PCR实验设计时应包括实验组（导入siRNA），阴性对照（Negative Control）和Mock Transfaction三组。每组至少三个重复。各组同时检测目标基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH为管家基因。
各组重复实验的Ct值差异不能过大；一般地，重复实验Ct值差异在1以内是可以接受的。
| 实验组 | 阴性对照（NC） | Mock Transfection | |||||||
| Target Gene | GAPDH | Target Gene | GAPDH | Target Gene | GAPDH | ||||
| 30.40 | 23.63 | 24.21 | 22.66 | 26.21 | 24.60 | ||||
| 30.35 | 23.40 | 24.60 | 22.56 | 26.15 | 24.31 | ||||
| 30.41 | 23.52 | 24.66 | 22.48 | 26.35 | 24.72 | ||||
以Mock Tansfection为对照（Calibrator），管家基因为Normalizer，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组－( Ct目的基因- Ct管家基因)对照
| Target Gene | GAPDH | ΔCt | ΔΔCt | Target Gene | |
| Average Ct | Average Ct | Target Gene–GAPDH | ΔCt–ΔCt, Mock | Rel. to Mock | |
| Mock | 26.24±0.10 | 24.54±0.21 | 1.7±0.21 | 0.00±0.21 | 1.0(1.16－0.86) |
| 实验组 | 30.39±0.09*1 | 23.51±0.15*2 | 6.88±0.17*3 | 5.18±0.17 | 0.027(0.0240.031) |
| NC | 24.49±0.24 | 22.56±0.09 | 1.93±0.25 | 0.23±0.25 | 0.85(0.71－1.01) |
|
注：*1 为同一样本重复实验的Ct值的标准偏差，可用Excel 计算得到； *2 计算公式为 ，例如 ＝0.17 *3 计算公式为2－△△Ct+S 和2－△△Ct－S，S为△△Ct的标准偏差，例如 2－(－2.5+0.10) ＝5.3 |
|||||
siRNA转染的方法
哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面：转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时的细胞密度、转染时的操作顺序、细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间。
A. GP-transfect-Mate 操作流程（24 孔板）
以24 孔板为例，若要检测基因沉默或者过表达效果，推荐最低RNA oligo终浓度为50nM
（DNA为0.5~1.5μg）；遵循以下操作方法可以高效地将RNA oligo或者DNA转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。但是对某些特殊的细胞系和培养条件，或特殊应用等，也需要单独特别优化，请参考表 1、表2。
1. 细胞铺板
转染时细胞密度：一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率(参见表1)。然而，不同细胞的最适转染密度都不尽相同，因此在初次转染某种细胞时，可以通过预实验先确认该细胞最佳的转染密度。
2. 转染复合物的制备
（1）将 GP-transfect-Mate转染试剂放置于室温中，使用前轻轻混匀。
（2）在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM，并添加适量的转染试剂(参见表2)，用移液器轻轻混匀，室温静置5 min。
（3）同时在另一1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM，并添加适量的RNA oligo/DNA (参见表2)，用移液器轻轻混匀，室温静置5 min。
（4）将GP-transfect-Mate-培养基混合物滴加至RNA oligo/DNA-培养基混合物中，用移液器轻轻混匀，室温静置15-20 min 后，立即转染。
注：复合物尽量在60 min内使用，并且GP-transfect-Mate-培养基混合物和RNA oligo/DNA-培养基混合物的混合次序非常重要，切勿颠倒。
3. 转染过程
（1）趁静置时，给 24 孔板换液，每孔换上 0.4ml 预热的新鲜培养基。
（2）将 100 µl 转染混合物加入孔中，终体系为500 µl。加完后将板轻轻晃动以使复合物均匀分布。
（3）37℃静置培养细胞，4-6h换成完全培养基。24-72 h检测mRNA表达，48-96 h检测蛋白表达。
适用范围
293T, A549, Beas-2B,HeLa,ECA-109,Raw264.7,A375,CAFs,HCT116,HT29,LMH,NE-4C,MGC803，PC-3, PC-12，MCF-7,C6等细胞。
表 1: 贴壁细胞或悬浮细胞接种数量、培养基体积
|
培养器皿 |
每孔表面积（cm2） |
每孔培养基的体积（ml） |
贴壁细胞转染前一天接种密度 |
悬浮细胞转染当天接种密度 |
|
|
96 孔板 |
0.3 |
0.1 |
5 000±2 500 |
2-5×104 |
|
|
24 孔板 |
2 |
0.5 |
25000±10 000 |
1-2.5×105 |
|
|
12 孔板 |
4 |
1 |
50000±20 000 |
2-5×105 |
|
|
6 孔板 |
10 |
2 |
150000±50 000 |
0.4-1×106 |
|
|
60mm |
20 |
4 |
400000±100 000 |
1-2.5×106 |
|
|
100mm |
60 |
10 |
1*106±250 000 |
2-5×106 |
|
注：贴壁细胞培养密度取决于培养器皿的表面积，而悬浮细胞则由培养基的体积决定。
表 2 不同培养板转染DNA/RNA oligo的推荐转染条件
|
培养器皿 |
Growth Medium |
Opti-MEM/ Serum-free Mediumfor complex |
DNA 转染 |
RNA转染 |
||
|
DNA/μg |
转染试剂/μl |
RNA/pmol |
转染试剂/μl |
|||
|
96 孔板 |
100 μl |
2×10μl |
0.2 |
0.4-1 |
20 |
0.5-1 |
|
24 孔板 |
500 μl |
2×50μl |
0.6 |
1.2-3 |
40 |
1-3 |
|
12 孔板 |
1ml |
2×100μl |
1.5 |
3-6 |
80 |
3-5 |
|
6 孔板 |
2 ml |
2×200 μl |
3 |
6-12.5 |
150 |
5-8 |
|
60mm |
5ml |
2×500 μl |
6-10 |
12-20 |
300 |
10-20 |
|
100mm |
10 ml |
2×1ml |
15-30 |
30-60 |
500 |
25-35 |
注：GP-transfect-Mate转染试剂的用量在此范围内进行优化。
B．Lipofectamin2000 转染试剂
选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于DNA/siRNA的共转染操作；是一种新型的高效siRNA转染试剂。
Lipofectamin2000的应用领域：
1、原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
2、siRNA高通量转染试验
3、DNA转染；DNA和siRNA的共转染
4、核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验
5、贴壁细胞和悬浮细胞转染
Lipofectamin2000 的特点：
1、不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作
2、在含血清培养基中也能表现高转染效率
3、细胞毒性低；适用细胞广泛
4、即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染
5、基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性
6、可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入
C. Lipofectamin2000适用的细胞类型
Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如：HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
D．转染前细胞培养
在细胞板上培养细胞时，应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。
E．合适的lipofectamin2000用量
合适的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响；我们推荐的DNA：lipofetamin2000为1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000为1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情况下，此范围内都可获得高的转染效率。
F．贴壁细胞转染程序
选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。
1、转染前一天，4-5´104细胞接种在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养基。
2、选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
3、在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；
4、混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μllipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；
5、将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。
6、将100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板。
7、 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。
G．悬浮细胞转染程序
1、转染的当天，收集细胞离心，用含FBS的培养基重悬。
2、在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；
3、混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μl lipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；
4、将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。
5、再加入400μL细胞悬浮液（细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间）。
6、细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。
H．DNA和siRNA共转染细胞
1、在转染的前一天，4-5´104细胞接种在24孔板上，0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。
2、选择用于初期接种的细胞密度，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
3、在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl lipofectamin试剂，充分混合，放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。
4、将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中，轻轻混匀。
5、细胞在37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它步骤。
I．siRNA体内导入方法
1、适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，因为注射液体积有限，建议采用高浓度的siRNA或DNA，一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。
2、取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的lipofectamin（24μg）和0.45μL不含RNA酶的无菌水中，将1#管中的溶液加入2#管中，在室温下温育30分钟，以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。
3、制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。
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目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类：
1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具
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