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公司产品
miRNA质粒载体
MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。
MicroRNA 表达载体构建
MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（如右图所示）。GenePharma MicroRNA载体利用CMV启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha（RNaseⅢ）作用形成small hairpin pre-miRNAs（约70nt），再过Dicer作用形成成熟的microRNA（约22nt），作用靶mRNA，起到表达调控作用。
microRNA过表达载体
吉玛提供两种过表达的方式：
1. 从天然的基因组序列中表达pre-miRNA转录本构建pre-microRNA。插入序列不仅包含pre-miRNA茎环结构，同时构建100-200bp长的上下游两端的侧翼序列。使用使用pol-Ⅱ（如CMV）启动子，这种构建方式保证高水平的表达pre-microRNA。表达出来的pre-miRNA的生理活动尽可能接近天然状态。
使用这种构建方式，客户只需提供miRNA的具体信息及指定过表达载体类型（如吉玛pEX系列 M核过表达载体，我们完成序列合成，质粒构建。
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目录号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
交货期限 |
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C09001 |
质粒型microRNA 过表达载体-1 (pre-miRNA+flanking sequences, ~500bp) |
50μg |
￥2,500 |
3-4周 |
2. 利用吉玛优化过的载体，模拟内源miRNA-155的表达模块，这种构建方法解决了不同miRNA表达效率差异的问题，同时也有效的避免了有些内源miRNA表达时产生-3p，-5p的问题。miRNA的发夹序列融合在EGFP报告基因的后面，模拟miRNA在体内的成熟过程。
GenePharma microRNA载体元件信息及用途
特征
用途
CMV
promoter
高表达目的基因
EmGFP
利用荧光显微镜观察转染效果
Blasticidin
resistance gene
可用来筛选稳定细胞系
Spectinomycin
筛选含有已经转化质粒的E. coli
pUC
origin
质粒可以在E. coli中进行高拷贝
使用这种构建方式，客户只需提供miRNA的具体信息，我们完成序列合成，质粒构建。
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目录号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
交货期限 |
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C09002 |
质粒型microRNA 过表达载体-2 (pGCMV/EGFP/miR/Blasticidin) |
50μg |
￥1,000 |
2-3周 |
备注：保证插入序列正确，不保证miRNA的过表达效率，不保证转染效率。所有实验仅供科研使用。
microRNA抑制子表达载体
吉玛提供两种miRNA抑制子载体构建的方式：
1. 利用吉玛优化过的载体，模拟内源miRNA-155的表达模块，来表达miRNA inhibitor序列。这种构建与吉玛miRNA过表达方式2使用同样的载体系统，方便客户使用同一套系统完成miRNA的过表达与抑制。
使用这种构建方式，客户只需提供miRNA的具体信息，我们完成序列合成，质粒构建。
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目录号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
交货期限 |
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C09003 |
质粒型microRNA 抑制子载体-1 (pGCMV/EGFP/miR/Blasticidin) |
50μg |
￥1,000 |
2-3周 |
2. miRNA sponge（海绵）载体构建：吉玛通过构建载体，表达包含多个成熟miRNA结合位点的RNA序列，通过吸附结合成熟miRNA，从而抑制miRNA的作用，从而进行功能缺失性研究。
miRNA sponge的特点：
a. 由于miR Sponges是由质粒编码的，它能够通过真核表达载体达到稳定沉默细胞microRNA的目的；
b. 能够沉默整个家族的microRNA以达到对整个家族microRNA功能的研究；
c. 可以利用miR Sponges实现体内外loss of function研究；
d. 可以用来检测luciferase靶基因报告系统分析；
e. 可以自由组合串联不同miRNA抑制子序列，达到沉默多种不同miRNA的目的。
使用这种构建方式，客户需提供miRNA的具体信息、预构建miRNA inhibitor的重复数及预构建inhibitor的序列信息，我们完成序列合成，质粒构建。
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目录号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
交货期限 |
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C09004 |
质粒型microRNA 抑制子载体-2 (microRNA inhibitor sponge, 3重复) |
50μg |
￥1,500 |
3周 |
microRNA靶基因荧光素酶报告载体
吉玛采用Promega的psicheck2.0的载体系统完成靶基因3’ UTR质粒载体构建服务。可提供基于人、小鼠、大鼠基因的UTR构建。
psicheck2.0报告基因检测系统用来检测siRNA/miRNA与靶基因是否可能存在调控作用，该报告系统报告荧光(hRluc)，其下游构建了靶基因3’UTR区域，通过对该荧光的监测，即可验证siRNA/miRNA对该靶标是否有调控作用；另有一校正荧光(hluc) 作为稳定内参，用于监测质粒表达效率。
严格的实验体系，要求miRNA与mRNA 3’ UTR验证实验中需要构建靶mRNA的点突变载体，以验证靶点作用有效性。突变载体构建主要依据预测的miRNA与靶基因3’UTR的稳定结合区域(即种子区)。通过种子区全部碱基或部分碱基突变导致miRNA与靶基因3’UTR区域的结合能力大大降低，从而判断是否存在miRNA的调控作用。
完成miRNA靶基因报告基因载体构建，需要客户提供：miRNA具体信息，预测靶基因信息，miRNA与靶mRNA结合位点信息。
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目录号 |
产品名称 |
规格 |
价格 |
交货期限 |
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C08005 |
双荧光素酶报告实验载体构建(≤500bp)a |
50μg |
￥2,500 |
3-4周 |
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C08006 |
双荧光素酶报告实验突变载体构建（种子区突变）b |
50μg |
￥2,500 |
3-4周 |
注：
a. 靶基因3’ UTR长度须小于500bp，否则价格及合成周期另计；
b. 单位点(即1个miRNA-mRNA作用位点) 突变价格如上，多位点突变价格及合成周期另计。
Lentivirus microRNA表达载体
目录号
产品名称
规格
价格
交货期限
C06001
慢病毒干扰载体LV-1
(pGLVU6/GFP)
50μg
询价
2周
C06002
慢病毒干扰载体LV-2N
(pGLVU6/Puro)
50μg
询价
2周
C06003
慢病毒干扰载体LV-3
(pGLVH1/GFP+Puro)
50μg
询价
2周
C06004
慢病毒干扰载体LV-9N
(pGLVU6/mCherry)
50μg
询价
2周
C06005
慢病毒干扰载体LV-10N
(pGLVU6/mCherry/Puro)
50μg
询价
2周
C06006
慢病毒干扰载体LV-12
(pGLVH6/luci05/Puro)
50μg
询价
2周
C06007
慢病毒干扰载体LV-15N
(pGLVH1/mCherry/Puro)
50μg
询价
2周
C06008
慢病毒干扰载体LV-16
(pGLVU6/Firefly/Puro)
50μg
询价
2周
C06027
慢病毒干扰载体 LV-U6-Neo
50μg
询价
2周
C06028
慢病毒干扰载体 LV-U6-copGFP-T2A-Neo
50μg
询价
2周
C06029
慢病毒干扰载体 LV-U6-mCherry-T2A-Neo
50μg
询价
2周
C06030
慢病毒干扰载体 LV-U6-Luci17-T2A-Neo
50μg
询价
2周
GenePharma microRNA 过表达载体库
吉玛公司已经利用自己的miRNA载体骨架成功构建为数众多的miRNA的过表达载体，载体库中的miRNA expression vectors 1周之内即可出货，价格更优。
| Name | Accession | Species | Seqence |
| hsa-miR-155 | MIMAT0000646 | Homo sapiens | UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU |
| hsa-miR-106b | MIMAT0000680 | Homo sapiens | UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU |
| hsa-let-7a | MIMAT0000062 | Homo sapiens | UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU |
| hsa-miR-15a | MIMAT0000068 | Homo sapiens | UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG |
| hsa-miR-16 | MIMAT0000069 | Homo sapiens | UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG |
| hsa-miR-17 | MIMAT0000070 | Homo sapiens | CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG |
| hsa-miR-143 | MIMAT0000435 | Homo sapiens | UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC |
| hsa-miR-145 | MIMAT0000437 | Homo sapiens | GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU |
| hsa-miR-125b | MIMAT0000423 | Homo sapiens | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA |
| hsa-miR-218 | MIMAT0000275 | Homo sapiens | UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU |
| hsa-miR-451 | MIMAT0001631 | Homo sapiens | AAACCGUUACCAUUACUGAGUU |
| hsa-miR-148a | MIMAT0000243 | Homo sapiens | UCAGUGCACUACAGAACUUUGU |
| hsa-miR-122 | MIMAT0000421 | Homo sapiens | UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG |
| dre-miR-737 | MIMAT0003768 | Danio rerio | AAUCAAAACCUAAAGAAAAUA |
| hsa-miR-21 | MIMAT0000076 | Homo sapiens | UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA |
| hsa-miR-194 | MIMAT0000460 | Homo sapiens | UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA |
| hsa-miR-150 | MIMAT0000451 | Homo sapiens | UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG |
| hsa-miR-491-5p | MIMAT0002807 | Homo sapiens | AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG |
| hsa-miR-15b | MIMAT0000417 | Homo sapiens | UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA |
| hsa-miR-29b | MIMAT0000100 | Homo sapiens | UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU |
| hsa-miR-30a | MIMAT0000087 | Homo sapiens | UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG |
| hsa-miR-29c | MIMAT0000681 | Homo sapiens | UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA |
| hsa-miR-195 | MIMAT0000461 | Homo sapiens | UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC |
| hsa-miR-7 | MIMAT0000252 | Homo sapiens | UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU |
| hsa-miR-886-5p | MIMAT0004905 | Homo sapiens | CGGGUCGGAGUUAGCUCAAGCGG |
| hsa-miR-182 | MIMAT0000259 | Homo sapiens | UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU |
| hsa-miR-497 | MIMAT0002820 | Homo sapiens | CAGCAGCACACUGUGGUUUGU |
| hsa-miR-375 | MIMAT0000728 | Homo sapiens | UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA |
| hsa-miR-26b | MIMAT0000083 | Homo sapiens | UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU |
| hsa-miR-128 | MIMAT0000424 | Homo sapiens | UCACAGUGAACCGGUCUCUUU |
| hsa-miR-200b | MIMAT0000318 | Homo sapiens | UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA |
| hsa-miR-320a | MIMAT0000510 | Homo sapiens | AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA |
| hsa-miR-196b | MIMAT0001080 | Homo sapiens | UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG |
| mmu-miR-19b | MIMAT0000513 | Mus musculus | UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA |
| hsa-let-7c | MIMAT0000064 | Homo sapiens | UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU |
| hsa-miR-9 | MIMAT0000441 | Homo sapiens | UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA |
| hsa-miR-373 | MIMAT0000726 | Homo sapiens | GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU |
| hsa-miR-338-3p | MIMAT0000763 | Homo sapiens | UCCAGCAUCAGUGAUUUUGUUG |
| hsa-miR-98 | MIMAT0000096 | Homo sapiens | UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU |
| hsa-miR-214 | MIMAT0000271 | Homo sapiens | ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU |
| dre-miR-16a | MIMAT0001774 | Danio rerio | UAGCAGCACGUAAAUAUUGGUG |
| bta-miR-139 | MIMAT0003788 | Bos taurus | UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU |
| bta-miR-30d | MIMAT0003533 | Bos taurus | UGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCU |
| hsa-miR-26a | MIMAT0000082 | Homo sapiens | UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU |
GenePharma MicroRNA载体简介
MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（如右图所示）。GenePharma MicroRNA载体利用CMV启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha（RNaseⅢ）作用形成small hairpin pre-miRNAs（约70nt），再过Dicer作用形成成熟的microRNA（约22nt），作用靶mRNA，起到表达调控作用。
GenePharma MicroRNA-neg-control实验设计
在使用载体法针对某一MicroRNA进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
实验对照组的确立
在一个完善的MicroRNA表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。通常，这些对照组包括载体阴性对照组、转染试剂对照组。
载体阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（microRNA），可以表达与目的基因序列无同源性的microRNA片段；另一种是将目的microRNA的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。
对照组的设立对于MicroRNA表达研究是很有必要的，您可以利用载体对照来确认microRNA实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。本试剂盒中包括GenePharma MicroRNA-NC过表达载体的对照，该载体在导入细胞中后，可以有效反应载体转染难易以及作为基因表达、RNA提取、基因检测等系统参考。
细胞转染条件的确定
使用MicroRNA载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA的导入情况。最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。吉玛公司提供的MicroRNA表达载体包含绿色荧光蛋白的表达框架，转入细胞后可以表达绿色荧光蛋白，用荧光显微镜或流式细胞仪可以很容易的确定转染效率。
MicroRNA表达的检测
通常用两大类方法来检测MicroRNA表达效率，一类方法是直接检测MicroRNA的变化水平，常用的方法如northern杂交、芯片（microarrays）以及核糖核酸酶保护分析，但这些传统的方法都需要用到标记探针与纯化的RNA进行杂交，由于成熟的miRNAs及其前体共享一段共同的靶序列，而且目前的这些方法有无法通过大小将其分开，因此很难专一识别成熟的MicroRNA，导致较高的背景信号。基于此，吉玛公司开发出Hairpin-itTM MicroRNAs qPCR Quantitation Kit，可以对任何种MicroRNAs 进行定量PCR检测，另外我们也可以根据客户要求制定特殊服务。 和另一类方法是通过检测目的基因的生物学效应和细胞效应来间接的反映目的基因的表达变化，这一类方法很多，不同的基因有不同的检测方法。通常选用直接检测MicroRNA的变化情况，可以很直观地反映基因的真实情况，不过也有一部分研究人员通过检测细胞效应如细胞增殖速率等指标间接反映基因变化。
GenePharma microRNA 过表达载体基本信息介绍
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GenePharma microRNA载体元件信息及用途 |
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特征 |
用途 |
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CMV promoter |
高表达目的基因 |
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EmGFP |
利用荧光显微镜观察转染效果 |
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Blasticidin resistance gene |
可用来筛选稳定细胞系 |
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Spectinomycin |
筛选含有已经转化质粒的E. coli |
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pUC origin |
质粒可以在E. coli中进行高拷贝 |
GenePharma miRNA质粒载体细胞转染方法
由于在MicroRNA表达实验设计中有多种条件选择如试剂和细胞株等，在本实验操作中以GenePharma MicroRNA-neg-control为对照，RNAi-Mate(或LipofectamineTM2000)为转染试剂，Hela细胞为实验细胞株，按照上述条件分步阐述MicroRNA实验的操作过程。如果用户使用不同的细胞株和转染试剂，可根据相应参考文献进行调整。
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1 转染条件的确定 您可选用表达绿色荧光蛋白直接来确定转染效率； 选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。DNA的用量及其与转染试剂的比例可在推荐范围内适当调整。 |
转染前一天，接种0.4-1.0×105细胞/孔至24孔板中，加入500μl含血清培养液，37ºC 5% CO2培养至40-70%融合。 |
| 在50 μl Opti-MEM I培养液或其它无血清培养液中加入0.5-0.8μg DNA，混匀。 | |
| 使用前轻轻混匀RNAi-Mate试剂，切忌离心处理。用30μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1-4μg RNAi-Mate试剂（可以分别设立DNA/RNAi-Mate的不同用量组，通常DNA和RNAi-Mate的用量在1：2-1：5范围内，针对不同的细胞需要不同的用量），轻轻混匀，室温放置5分钟。 | |
| 将稀释好的DNA和RNAi-Mate试剂混合，定容到100μl；轻柔混匀，室温放置30分钟，以便形成DNA-Mate复合物。 | |
| 将100μl DNA/RNAi-Mate复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板，使DNA/RNAi-Mate混合物均匀覆盖细胞。 | |
| 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。 | |
| 通过表达绿色荧光蛋白的DNA载体来检测细胞的转染效率，细胞转染后24-48 h后，使用荧光显微镜观察计数表达绿色荧光蛋白的细胞，在明场观察计数同一视野中的总细胞数，转染细胞率=荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×100%。或使用DAPI等染料染核后，使用流式细胞仪进行计数，然后计算转染效率。 | |
| 如果在转染条件摸索实验中没有找到较高效率的转染方法，请更换转染方法和试剂。如无其他方法选择，可以使用流式细胞仪将转染的细胞分选出来用于后续实验。如果无法分选细胞，可以在计算RNA干扰抑制效率时去除转染效率的影响，也可以使用抗生素对转染后的细胞进行初筛后再进一步检测抑制效率。 | |
| 2 细胞的转染 | 设定合理的实验组，包括转染试剂对照（mock transfection）、阴性对照(negative control)和目的基因实验组。 |
| 按照前面实验确定的细胞接种量接种。37ºC 5% CO2培养至40-70%融合。 | |
| 按照前面实验确定的转染条件转染细胞。如果需要转染不同培养量的细胞，试剂的用量可以根据相关参考进行相应的变化。 | |
| 转染后24-48h后，收集细胞进行下一步的检测工作。通常，目的基因在转染后24-48h内就会表现出现表达，但有一些蛋白比如稳定性较强、半衰期较长的蛋白在转染后含量降低比较缓慢，所以需要延长检测时间。 | |
| 3 稳定细胞系建立 | 前一天，准备健康细胞，密度在20%-40%。 |
| MicroRNA表达载体和对照，按照转染试剂推荐要求，进行细胞转染，6小时后换成新鲜培养液，培养过夜。 | |
| 第二天，胰酶消化，将细胞转入较大的培养瓶中（如6孔板转到10cm plates），加入完全培养液并含有适当浓度的Blasticidin。 | |
| 每3-4天更换含有适当浓度的Blasticidin，直到Blasticidin抗性克隆形成（一般需要11-14天药物筛选）。 | |
| 挑取至少10个耐药克隆进行扩增。 | |
| 4 基因抑制效率的检测 | 在本公司的《RNAi产品使用手册》（14页-19页）中较详细地介绍了使用荧光定量PCR技术和Western blot方法检测目的基因表达变化的操作步骤和注意事项，用户可以酌情选用。 |
| 用户也可选用其他间接的方法（如目的基因的生物学功能或细胞生物学特性的变化）来检测目的基因的抑制情况。鉴于这方面的检测手段多种多样，需要用户自己进行选择，在此不再赘述。 |
Li J, Wang F, Wang G, Sun Y, Cai J, Liu X, Zhang J, Lu X, Li Y, Chen M, Chen L, Jiang C. Combination epidermal growth factor receptor variant III peptide-pulsed dendritic cell vaccine with miR-326 results in enhanced killing on EGFRvIII-positive cells. Oncotarget. 2017 Apr 18; 8(16): 26256-68.
Zhang, H., M. Qi, et al. "microRNA-9 targets matrix metalloproteinase 14 to inhibit invasion, metastasis, and angiogenesis of neuroblastoma cells." Molecular Cancer Therapeutics 11(7): 1454-1466.
Liang, G. F., S. Chen, et al. "Construction of MiRNA Eukaryotic Expression Vector and its Stable Expression in Human Liver Cancer Cells." Procedia Environmental Sciences 8: 451-456.
Zhang, H., J. Pu, et al. "MicroRNA-145 inhibits the growth, invasion, metastasis and angiogenesis of neuroblastoma cells through targeting hypoxia-inducible factor 2 alpha." Oncogene.
Zheng, L., J. Pu, et al. "microRNA-145 targets v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 to suppress the invasion, metastasis and angiogenesis of gastric cancer cells." Molecular Cancer Research.
目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类：
1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具
产品价格 本产品目录中标示的价格均为国内统一零售参考价，全部为人民币价格。如果大量定购时，在标准价格的基础上有不同程度的优惠。
质量保证 凡吉玛公司的产品均有严格的质量保证。如果我们发现确实存在质量问题时，保证更换产品。如果在到货后一个月之内用户无提出异议，我们将视本产品为优良产品而不再受理投诉事宜。提出产品异议（或投诉）时，切莫在产品使用完（或快使用完）后提出，以备本公司回收产品，确认产品质量。由于订错产品而产生的退货情况，原则上由客户承担相关费用。发生投诉事宜时，公司只保证在产品价格额度范围之内酌情赔偿，恕不受理超过制品价格额度以上之部分。退款时需退还原始发票。
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（1）当日17：00前，免费修改或取消。
（2）当日17：00到次日17：00前，按该项产品金额的50%收取。
（3）次日17：00后，按该项产品金额的100%收取。