产品描述

AAV技术服务

吉玛基因科研团队现已经推出腺相关病毒(AAV)包装技术服务。专业的科研团队，一流的技术服务，欢迎来电咨询。

产品简介

腺相关病毒(Adeno-Associated Viral Vector, AAV)属于微小病毒科，是一种无包膜的单链线装DNA病毒。AAV的基因组约为4700bp，包括上下游共两个开放读码框(ORF)，位于两个反向末端重复序列
(ITR)之间(图1)。腺相关病毒具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、可感染分裂细胞和非分裂细胞，能接到长期稳定表达和物理性质稳定等优点，已经被广泛地应用于基础实验和临床科研中，也是
目前全球广泛用于基因治疗的载体。

1. 安全性高：迄今从未发现野生型AAV 对人体致病，重组AAV 基因组序列上去 除了大部分的野生型AAV 基因组元件，进一步保证了安全性；

2. 免疫原性低：AAV2 的基因组仅 4681个核苷酸，便于用常规的重组 DNA技术 进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；

3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；

4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；

5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；

AAV具有多种血清型，各种不同血清型AAV载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同组织和细胞的侵染效率存在差异。目前吉玛基因在包装腺相关病毒时有 各种 血清型可供客户选择
，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒，见下表。

腺相关病毒对照
吉玛提供无关序列腺相关病毒阴性对照，阴性对照价格实惠!

需要干冰件运输，除江浙沪外所有地区，需要加收￥300 运费。

shRNA腺相关病毒产品

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过表达腺相关病毒

吉玛腺相关病毒收费标准：

对于高GC，重复序列或较长序列等特殊情况，费用需要特殊评估.

吉玛全基因合成腺相关病毒载体类型：

功能介绍与实验实例

靶细胞感染预实验

1） 试验前一天分别接种 3~5×10 3 个目的细胞于 96 孔培养板每孔中，所加培养基体积为 100uL。不同种类的细胞生长速度有所差异，为保证有较好的实验结果，进行病毒感染时细胞的融合度为 60~80%。因为腺相关病毒表达需要一定的时间，故在进行感染实验时细胞接种不宜过密。

2） 干扰预试验共分为二组，每组均有不同梯度的 MOI 值（Multiply of Infection） 。第一组为正常情况下感染，也就是在完全培养基中直接加入病毒。第二组为感染时添加 3~8 ug/mL 的 Polybrene。Polybrene 在大部分细胞中可以有效的提高感染效率。

3） 感染前为细胞换液， 吸去细胞上清， 按不同的分组情况加入所需的培养基90uL，每组三个复孔。

4） 准备 3 个无菌的 EP 管，吸取 10ul 的 1×10^8 TU/ml 的病毒（预先从-80℃取出，迅速融化，4℃低温操作）加入到第一个管子中，轻柔混匀，勿产生泡沫。同样从第一管中吸取 10ul 的病毒到第二管中，混匀。再从第二管中吸取 10ul 的病毒到第三管中，混匀。这样就得到了四个不同梯度的病毒：原液，10 倍稀释，100 倍稀释，1000倍稀释。

5） 把细胞放回培养箱孵育。

6） 8~12 小时以后，请观察细胞状态。如果细胞状态与未感染组无明显差异，表明腺相关病毒对细胞没有明显毒性作用，请不要换液，继续培养，直至 24 小时后更换为新鲜培养基。

7） 感染 48~72 小时后，观察荧光表达情况。对于生长迟缓代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液保持细胞的良好状态。

8） 以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞的分盘上，它不需要提前一天分盘。 操作时直接将细胞离心后悬浮在不同的培养基中， 计数分盘后，即可加入病毒。

10）通过首次实验和重复实验，确认目的细胞的感染方法和感染参数。

正式试验

    通过预实验可以帮助确定使用重组腺相关病毒颗粒感染目的细胞的优化条件， 如细胞接种密度，是否需要添加 Polybrene，合适的 MOI 值等参数。正式实验前，调整并保持细胞的良好状态是非常重要的。 有些对Polybrene敏感， 建议不能添加Polybrene去增强感染效率。

    腺相关病毒表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如 293T，BHK21 等）上， 病毒感染 24hrs 后可以观察到 GFP 荧光； 代谢比较缓慢的细胞 （如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）GFP 蛋白表达时间较长，感染后 72-96hrs 甚至更长时间才可以观察到 GFP 荧光。感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察 GFP 的表达时间和表达强度来确定腺相关病毒对目的细胞的感染情况。 感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态。

运输和储存

   对于长距离运输，应先将腺相关病毒载体保存在-80℃，再采用全程干冰运输，以防滴度下降。

   腺相关病毒载体在-80℃保存 6 个月，滴度不会明显下降。建议保存 6~12 个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融（小于 3 次） 。使用前从-80℃取出病毒，室温迅速融化，操作过程应置于冰盒上进行。用不完的病毒可以暂时放在-20℃冰箱中，但最好尽快用完。

使用方法

病毒滴度复核

方法一：有限稀释法测定

1）滴度检测前一天，对 293T 细胞传代，96 孔板每个孔加入约 0.5~10×10 3个细胞，体积 100ul；

2）第二天，准备 7~10 个无菌 EP 管，在每个管中加入 90ul 的新鲜完全培养基（高糖 DMEM+10%FBS）；

3）取待测定的病毒原液 10ul 加入到第一个管中，轻轻混匀后，取 10ul 加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；

4）选取所需的细胞孔，吸弃 90ul 培养液，然后将稀释好的病毒液，从低浓度到高浓度依次加入，放入 37℃ 5% CO2 培养箱中培养；

5）24 小时后，每孔换入 100ul 新鲜培养液，小心操作，不要吹起细胞；放入37℃ 5% CO2 培养箱中继续培养。

6）3 天后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最后二个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数，将得到的数值除以各自相应的稀释倍数，即可计算出病毒原液的滴度值（通常以倒数第二个孔中的读数值更为准确）。

注释：

（1）典型的病毒滴度测定结果见图一（Fig. 1） ；

Fig. 1 典型的腺相关病毒滴度

（2）病毒滴度测定结果还依赖于本身实验系统，如 293T 细胞代数、细胞状态、荧光显微镜品质、相关实验试剂及实验人员操作技能，因此不同实验室测得滴度数值会有

所差异（2~10 倍） ，但基本不会影响正常实验流程；

（3）病毒滴度(BT = TU/ml, transducing units)计算方法：TU/uL=（P×N/100×V）×1/DF，P=%GFP+cells，N=转染时的细胞数，V=每孔加入病毒稀释液体积 （uL） ， DF=稀释因子 （dilution factor） =1 （undiluted） 、 10 -1 (diluted 1/10)、10 -2 (diluted 1/100)。

产品说明书

相关文献

Xin Liu, Yunze Liu, Zhao Liu, Changwei Lin, Fanchao Meng , Lei Xu , Xiuzhong Zhang ,Chong Zhang , Penbo Zhang , Shuai Gong , Nai Wu , Zeqiang Ren , Jun Song and Yi Zhang. CircMYH9 drives colorectal cancer growth by regulating serine metabolism and redox homeostasis in a p53-dependent manner    Molecular Cancer 2021 Dec;20(1):1-19 .

Yebei Lia, Daijin Rena, Yunfeng Shenb, Xiaoxu Zhengc, Gaosi Xua. Altered DNA methylation of TRIM13 in diabetic nephropathy suppresses mesangial collagen synthesis by promoting ubiquitination of CHOP.EBioMedicine  2020 Jan 2; 102582.

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1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具 

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