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吉玛全程服务

用户提供整体实验方案,吉玛通过评估客户需求,围绕公司特色,结合现有平台及扩展平台,利用分子细胞生物学技术,提供真实实验数据,完成客户外包试验。

产品描述

用户提供整体实验方案,吉玛通过评估客户需求,围绕公司特色,结合现有平台及扩展平台,利用分子细胞生物学技术,提供真实试验数据



1、 筛选有效的干扰片段或病毒


 1.1 摸索细胞最佳转染或侵染条件 荧光蛋白指示转染效率(一般达70%以上)
 1.2 RT-PCR
 1.2.1 RNA提取质量检测电泳图
 1.2.2 RT-PCR扩增曲线示例(三重复避免系统误差)
 1.2.3 RT-PCR数据分析示例(计算组内误差)
 1.2.4 RT-PCR结果柱状图示例(检测干扰效率)
 1.2.5 靶基因与内参溶解曲线图(检测扩增质量)
 1.2.6 DNA片段扩增质量检测电泳图
 1.3 Western Blot
 1.3.1 蛋白电泳图
 1.3.2 灰度分析图

 2、 双荧光素酶系统检测siRNA,microRNA有效性

吉玛采用荧光素报告载体系统完成靶基因3' UTR质粒载体构建服务。可提供基于人、小鼠、大鼠基因的UTR构建。 psicheck2.0报告基因检测系统用来检测siRNA/miRNA与靶基因是否可能存在调控作用,该报告系统报告荧光(hRluc),其下游构建了靶基因3' UTR区域,通过对该荧光的监测,即可验证siRNA/miRNA对该靶标是否有调控作用;另有一校正荧光(hluc)作为稳定内参,用于监测质粒表达效率。 严格的实验体系,要求miRNA与mRNA3'UTR验证实验中需要构建靶mRNA的点突变载体,以验证靶点作用有效性。突变载体构建主要依据预测的miRNA与靶基因3' UTR的稳定结合区域(即种子区)。通过种子区全部碱基或部分碱基突变导致miRNA与靶基因3' UTR区域的结合能力大大降低,从而判断是否存在miRNA的调控作用。 完成miRNA靶基因报告基因载体构建,需要客户提供:miRNA具体信息,预测靶基因信息,miRNA与靶mRNA结合位点信息。


目录号 产品名称 规格 价格 交货期
C09005 双荧光素酶报告实验载体构建(≤500bp)a 50 μg ¥2,500 20-30个工作日
C09006 双荧光素酶报告实验突变载体构建(种子区突变)b 50 μg ¥2,500 20-30个工作日


注:
a.靶基因3' UTR长度须小于500bp,否则价格及合成周期另计;
b.单位点(即1个miRNA-mRNA作用位点)突变价格如上,多位点突变价格及合成周期另计。



2.2双荧光素酶报告系统检测服务

吉玛公司利用同时表达萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的双荧光素酶系统,将靶基因的CDS区或3' UTR种子区构建入载体,通过荧光素酶底物荧光的变化,来佐证siRNA或miRNA与靶基因结合的强弱。


吉玛公司根据客户实验所需,为客户提供贴心的套餐搭配(以下均针对插入载体序列<500bp)


套餐搭配 价格 周期
A-1.结合靶点预测和UTR序列载体构建 2500元/载体 10-15个工作日
A-2.结合靶点预测和UTR序列载体构建+加突变体构建 4000元/一对载体 15-20个工作日
B-1.干扰序列/mimics (2 OD) +构建结合靶点载体(50 μg) 3500元/靶点 10-15个工作日
B-2.干扰序列/mimics (2 OD) +构建结合靶点载体(50 μg)+构建加突变体(50 μg) 5500元/靶点 10-15个工作日
C-1.干扰序列/mimics (2 OD) +构建结合靶点载体(50 μg)+验证服务 10000元/靶点 20-25个工作日
C-2.干扰序列/mimics (2 OD) +构建结合靶点载体(50 μg)+构建加突变体+验证服务 12000元/靶点 20-25个工作日


2.3 双荧光素酶报告基因检测试剂盒

产品名称 货号 规格 组分 储存 价格(元)
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit双荧光素酶报告基因检测试剂盒 G06001 100次 细胞裂解液(5×) 15mL -20℃避光 ¥1,118
萤火虫荧光素酶底物(200×) 50μL 
萤火虫荧光素酶缓冲液 10mL
海肾荧光素酶底物(200×)50μL
海肾荧光素酶缓冲液 10mL


 

3、 进行下游细胞实验
 
3.1 下游靶基因表达量的鉴定
 
常规出示的结果同样包括:RT-PCR、Western,如果涉及分泌蛋白,可以进行Elisa实验,客户可指定检测方法
 
3.2 稳定株筛选实验
 
在药物压力下筛选稳定表达细胞株,常规出示结果包括:RT-PCR、Western,客户可指定筛选及检测方法。 实验过程:1.抗生素筛选浓度确定(致死曲线):2. 细胞接种:转染实验前天接种细胞。转染时细胞密度达到60%~80%;3. 细胞转染(脂质体)或侵染(慢病毒)4. 利用质粒抗性筛选稳定干扰细胞株;5. 目的基因干扰效果验证。 周期2-3个月,提供T25稳筛细胞株一瓶,具体价格敬请来电咨询。
 
3.3 克隆形成率实验
 
采用结晶紫或吉姆萨染色法,检测转入靶基因后细胞增殖情况,常规出示结果包括:克隆染色图及柱状分析图
 
3.4 细胞增殖实验
 
采用CCK8或MTT方法,检测细胞增殖的情况,使用CCK-8方法: 据活细胞线粒体内的脱氢酶可将试剂中的有效成分转变为有颜色的Formazan,并可被酶标仪检测,间接反应活细胞数量。具体价格敬请来电咨询。(包括4组细胞,每个样品3-5个复孔,客户可以选择检测时间点。)
 
常规出示结果包括:
 
3.4.1原始读数(每个样品5个重复)
 
3.4.2细胞增殖曲线图
 
3.5细胞周期实验
 
采用PI染色的方法,在流式细胞仪上对细胞样品进行细胞周期分析
 
3.6 细胞凋亡的分析
 
采用Annexin V / PI ;Annexin V-PE /7-AAD或客户自己提供合适的试剂盒,在流式细胞仪上对细胞样品进行细胞。

3.7 细胞迁移实验(Transwell)
 
采用结晶紫或DAPI染色法,检测细胞迁移的能力。或用划痕进行检测。客户需提供:检测细胞及其培养条件和处理方法。选择观察时间点。

3.8 细胞侵袭实验(Transwell+ Matrigel Basement Membrane Matrix)
 
采用结晶紫或DAPI染色法,检测细胞侵袭的能力,铺有Matrigel的特殊滤膜,正常细胞不能自由穿过。在下室中加入趋化剂,上室加有经过处理的重悬肿瘤细胞,具有侵袭能力的肿瘤细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动,并粘附在滤膜下表面。具体价格敬请来电咨询。
 
3.9 细胞划痕实验
 
通过对划痕部位距离差异的计算,检测细胞迁移能力
 
3.10 Confocol实验:
 
通过融合荧光蛋白或荧光二抗,鉴定目标蛋白细胞内定位,利用抗原-抗体特异性结合的原理,用经荧光染料标记的抗体对细胞内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。流程:细胞爬片 转染或药物处理 固定透化 封闭 一抗孵育 荧光二抗孵育 荧光显微镜观察拍照。客户需要提供荧光一抗及二抗,具体价格敬请来电咨询。

3.11 粘附实验部分:

本平台是借助CCK8试剂盒可以检测活细胞的功能,检测不同处理组间的粘附差异。

3.12 酶联吸附实验(ELISA) 4步骤帮您轻松检验各种蛋白大分子抗原:

(1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。(2)加受检标本,保温反应,去除未结合物质。(3)加酶标抗体,保温反应。固相免疫标抗体结合。(4)加底物显色。服务价格:检测3-5组样品,每组样品3个复孔,具体价格敬请来电咨询。

服务收费标准
目录号 产品名称 价格 交货期限
H02001 RNAi设计服务 询价 2个工作日
H02002 RNAi相关试剂的合成服务 询价 1周
H02003 RNAi转染优化服务 询价 1周
H02004 RNAi干扰效果检测服务 询价 2周
H02005 RNAi稳定细胞株的筛选 询价 2个月
H03001 流式细胞技术检测服务 询价 1周
H04001 细胞周期检测服务 询价 1周
H04002 细胞凋亡检测服务 询价 1周
H04003 细胞活性测定服务 询价 2周
H04004 细胞基质黏附实验服务 询价 1-2周
H04005 细胞侵袭实验服务 询价 1-2
H04006 细胞免疫荧光实验 询价 1-2周
H04007 细胞免疫吸附实验 询价 1-2周






功能介绍与实验实例

1.筛选有效的干扰片段和慢病毒

1.1  摸索细胞最佳转染或侵染条件(一般达70%以上)





收取样品后,针对靶基因进行RT-PCR及Western Blot检测:样品一般包括以下分组:NC(阴性对照组)、B(Blank不作处理组)、M(Mock单加转染试剂组)及实验样品组

1.2  RT-PCR提供的数据

1.2.1  RNA提取质量检测电泳图
 




1.2.4  RT-PCR结果柱状图示例(检测干扰效率,样品包括:NC(阴性对照组)、B(Blank不作处理组)、M(Mock单加转染试剂组)及实验样品组)





3. 进行下游细胞实验
 
3.1  下游靶基因表达量的鉴定:常规出示的结果同样包括:RT-PCR、wetern,如果涉及分泌蛋白,可以进行Elisa实验,客户可指定检测方法


3.2   稳定株筛选实验:在药物压力下筛选稳定表达细胞株,常规出示结果包括:RT-PCR、Western,客户可指定筛选及检测方法



3.3  克隆形成率实验:采用结晶紫或吉姆萨染色法,检测转入靶基因后细胞增殖情况,做三重复,消除系统误差






3.4  细胞增殖实验:采用CCK8或MTT方法,检测细胞增殖的情况

3.4.1  原始读数(每个样品5个重复)



3.6  细胞凋亡的分析:采用Annexin V+PI双染色法,对细胞进行凋亡分析


3.7  细胞迁移实验(Transwell):采用结晶紫或DAPI染色法,检测细胞迁移的能力(图示为结晶紫染色法)







3.8  细胞侵袭实验(Transwell+ Matrigel Basement Membrane Matrix):
 
采用结晶紫或DAPI染色法,检测细胞侵袭的能力(图示为DAPI染色法)


3.9  细胞划痕实验:通过对划痕部位表面积的计算,检测细胞迁移能力
 







 


 



使用方法

使用方法

产品说明书

相关文献

1.De Silva, T., G. Ye, et al. "Frontiers." Frontiers in Experimental Endocrinology 3.

2.Qi, R., S. Liu, et al. "Biodegradable copolymers with identical cationic segments and their performance in siRNA delivery." Journal of Controlled Release.

3.Zhang, C. Y., J. Chen, et al. "The Contribution of 17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 to the Estradiol-Estrone Ratio in Estrogen-Sensitive Breast Cancer Cells." PloS one 7(1): e29835.

4.Hou, H., Y. Zhang, et al. "Inhibitors of Phosphatidylinositol 3鈥?Kinases Promote Mitotic Cell Death in HeLa Cells." PloS one 7(4): e35665.

5.Ye, Q. F., Y. C. Zhang, et al. "siRNA-mediated Silencing of Notch-1 Enhances Docetaxel Induced Mitotic Arrest and Apoptosis in Prostate Cancer Cells." Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 13: 2485-2489.

6.Lu, J., D. Sun, et al. "Selection of an Effective Small Interference RNA to Silence Myostatin Gene Expression in Sheep Fibroblast Cells." Biochemical Genetics: 1-10.

7.Tao, Q., X. Fan, et al. "Gender segregation in gene expression and vulnerability to oxidative stress induced injury in ventral mesencephalic cultures of dopamine neurons." Journal of Neuroscience Research.

8.Yuan, Z., X. Wu, et al. "Asymmetric siRNA: new strategy to improve specificity and reduce off-target gene expression." Human Gene Therapy(ja).

9.Lin, Q., J. Chen, et al. "Efficient systemic delivery of siRNA by using high-density lipoprotein-mimicking peptide lipid nanoparticles." Nanomedicine(0): 1-13.

10.Li, S., Z. Liu, et al. "Delivery of Quantum Dot-siRNA Nanoplexes in SK-N-SH Cells for BACE1 Gene Silencing and Intracellular Imaging." Molecular Therapy鈥擭ucleic Acids 1(4): e20.
Na, L., S. M. Min, et al. "S100A4 siRNA Inhibits Human Pancreatic Cancer Cell Invasion In Vitro." Biomed Environ Sci 25(4): 465-470.

11.Gu, Y. H., X. B. Yan, et al. "NR2B-siRNA Mediated by Hydroxyapatite Nanoparticles Relieves for Malin-Induced Pain of Mice." Advanced Materials Research 343: 926-932.
De Silva, T., G. Ye, et al. "Nodal promotes glioblastoma cell growth." Frontiers in Endocrinology 3.

12.Liang, Y., Z. Liu, et al. "Delivery of cationic polymer-siRNA nanoparticles for gene therapies in neural regeneration." Biochemical and Biophysical Research Communications.

13.Sun, Z., Q. Luo, et al. "Role of toll-like receptor 4 on the immune escape of human oral squamous cell carcinoma and resistance of cisplatin-induced apoptosis." Molecular Cancer 11(1): 33.

14.Han, M., Q. Lv, et al. "Overcoming drug resistance of MCF-7/ADR cells by altering intracellular distribution of doxorubicin via MVP knockdown with a novel siRNA polyamidoamine-hyaluronic acid complex." Journal of Controlled Release.

订购须知

服务收费标准
目录号 产品名称 价格 交货期限
H02001 RNAi设计服务 询价 2个工作日
H02002 RNAi相关试剂的合成服务 询价 1周
H02003 RNAi转染优化服务 询价 1周
H02004 RNAi干扰效果检测服务 询价 2周
H02005 RNAi稳定细胞株的筛选 询价 2个月
H03001 流式细胞技术检测服务 询价 1周
H04001 细胞周期检测服务 询价 1周
H04002 细胞凋亡检测服务 询价 1周
H04003 细胞活性测定服务 询价 2周
H04004 细胞基质黏附实验服务 询价 1-2周
H04005 细胞侵袭实验服务 询价 1-2周
H04006 细胞免疫荧光实验 询价 1-2周
H04007 细胞免疫吸附实验 询价 1-2周

细胞基质黏附实验服务:CKK-8法进行检测。客户需提供:检测细胞及其培养条件和处理方法。选择观察时间点。检测包括3-5组细胞,每组3个重复。我们提供的结果包括:1细胞黏附情况照片。2(可选)酶标仪检测的原始数据与统计分析结果。具体价格敬请来电咨询。

细胞免疫荧光实验:利用抗原-抗体特异性结合的原理,用经荧光染料标记的抗体对细胞内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。流程:细胞爬片 转染或药物处理 固定透化 封闭 一抗孵育 荧光二抗孵育 荧光显微镜观察拍照。客户需要提供荧光一抗及二抗,具体价格敬请来电咨询。

酶联吸附实验(ELISA)4步骤帮您轻松检验各种蛋白大分子抗原:(1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。(2)加受检标本,保温反应,去除未结合物质。(3)加酶标抗体,保温反应。固相免疫标抗体结合。(4)加底物显色。服务价格:检测3-5组样品,每组样品3个复孔,具体价格敬请来电咨询。

细胞迁移、侵染实验服务项目:铺有Matrigel的特殊滤膜,正常细胞不能自由穿过。在下室中加入趋化剂,上室加有经过处理的重悬肿瘤细胞,具有侵袭能力的肿瘤细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动,并粘附在滤膜下表面。具体价格敬请来电咨询。

细胞增殖实验使用CCK-8方法: 据活细胞线粒体内的脱氢酶可将试剂中的有效成分转变为有颜色的Formazan,并可被酶标仪检测,间接反应活细胞数量。具体价格敬请来电咨询。(包括4组细胞,每个样品3-5个复孔,客户可以选择检测时间点。)

稳定细胞株筛选服务: 1.抗生素筛选浓度确定(致死曲线):2. 细胞接种:转染实验前天接种细胞。转染时细胞密度达到60%~80%;3. 细胞转染(脂质体)或侵染(慢病毒)4. 利用质粒抗性筛选稳定干扰细胞株;5. 目的基因干扰效果验证。 周期2-3个月,提供T25稳筛细胞株一瓶,具体价格敬请来电咨询。

miRNA靶基因预测双荧光素酶报告系统:吉玛采用promega的psicheck2.0载体系统构建靶基因3'UTR系统。该系统可检测siRNA/miRNA与靶基因的调控关系,报告荧光(hRluc)验证si/miRNA调控作用,校正荧光(hluc)检测质粒表达效率。另外客户还可选择构建突变UTR系统。具体价格敬请来电咨询。

荧光素报告载体

a. 构建费用2*基因长度,低于2500元的按照2500元计算;构建野生与突变一对的按照4000元计算。

b. 序列超过3kb,或特殊序列高GC重复序列等特殊询价周期12-25个工作日。

c. 我们确保将客户指定序列构建正确(有测序结果证实,对于高GC重复序列可能会有缺失,评估后都会予以说明),如有缺失会免费重复修复一次。由于均为预测性实验,不保证其符合预期功能。目前我们验证URTmiRNA结合阳性率大约80%;启动子工作阳性率的70%

d. 如需本公司验证gene 3'UTRmiRNA作用,或启动子表达验证。一个靶点一株细胞验证服务费用6000元(产品收费另计,如果包括产品一起报价费用1万。周期25-30个工作日)。收到50%预付款启动实验,收到全款,提交全部原始数据。保证实验阳性阴性质控结果。不保证其预测信息符合实验预期。



项目具体价各和实验相关事宜请联系吉玛公司:rnaisupport@genepharma.com,电话:021-51320195-8009。双方协商一致后签订技术服务合同,我们严格按照服务合同开展技术服务。

下单前请务必核对订购表客户信息和订购内容无误,订单一经确认,当天即启动生产。 超过当日17:00后不能修改或者取消,如果需要取消订单,由此产生的费用,将由客户承担。

【取消订单费用规则】

(1)当日17:00前,免费修改或取消。

(2)当日17:00到次日17:00前,按该项产品金额的50%收取。

(3)次日17:00后,按该项产品金额的100%收取。


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