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  产品介绍
第二代测序技术(Next generation sequencing)是近几年出现的一项革命性测序技术, 利用其高通量高覆盖度的优势, 可以在极短的时间内获取数百万甚至数十亿的序列数据信息。
GS FLX 系统是由罗氏454 生命科学公司推出的目前应用最广的超高通量基因组测序系统, 10h内完成一个测序反应,单反应读长由最初的100 bp己经扩展到了目前的400bp,准确性达99%,产出数据量达1亿碱基对,每次运行可分析16个非混合的独立样品,已经应用于微生物、人类、动物、植物等的基因组分析。它是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。其基本原理和操作过程如图所示:
 
基本原理
(1)    将1条特异性的测序引物和单链DNA模板结合,然后加入四种酶混合物,DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase),以及底物混合物APS(adenosine 5’phosphosulfate,腺苷-5’-磷酸硫酸酐)和荧光素(luciferin)。
(2)    在反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对,则会在DNA聚合酶的作用下,添加到测序引物的3’末端,同时释放一个分子的焦磷酸(PPi)。
(3)    在ATP硫酸化酶的作用下,生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下,生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素(Oxyluciferin),同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
(4)    反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在apyrase的作用下发生降解,并生成磷酸盐。
(5)    加人另一种dNTP,使第②一④步反应币复进行,根据获得的峰位图即可读取准确的DNA序列信息。
操作过程:
1.文库制备:根据样品的种类和实验目的,将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间,经末端修复与特异性接头连接等修饰后,变性处理,回收单链的DNA;
2.乳滴 PCR:将文库DNA与磁珠按照特定比例与E-PCR试剂混合后,形成油包水的混合物,使大部分磁珠携带了一个独特的单链DNA片断,用聚合酶进行单分子的扩增,达到放大信号以方便测序的效果。
3.测序反应:携带DNA模板的磁珠与其他反应物混合物,随后放入PTP板中,然后将PTP板放置在GS FLX中,测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号,并被CCD照相机所捕获;
4、数据分析:GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长,读取超过4-6亿个碱基信息,通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。
 
Illumina公司的Genome Analyzer系统
Genome Analyzer仪器是Illumine公司于2007年推出的测序仪,它是基于合成测序法及可逆末端终止反应建立起来的技术平台。基本原理如下:
在扩增过程中加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些dNTP 3´羟基末端带有可化学切割的部分,每个循环只充许掺入单个碱基。此时,用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种标记的荧光信号转换为碱基。然后,将这些基团化学切割,恢复3'端活性,继续聚合第二个核苷酸。经过数次循环,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样,统计每轮收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DNA片段的序列。
目前的配对末端读长可达到2×150 bp,更长的读长也能实现,但错误率会增高。
图 桥扩增测序原理及过程
基因组DNA经片段化形成几百个碱基(或更短)的小片段,然后在片段的两端添加接头。单链DNA的接头与芯片上的单链引物之间形成碱基互补配对,单链DNA片段的一端固定在芯片上,用芯片上的引物,以单链DNA序列为模板进行扩增,使得单链DNA成为双链DNA。该双链变性解离后成为单链一端以同样的方式固定在芯片上,另外一端随机地与附近的另外一个引物互补,在芯片上形成桥。
1. 文库制备
将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片段,在片段的两个末端加上接头(adapter)。
2. 产生DNA
单链DNA的接头与芯片上的单链引物之间形成碱基互补配对,单链DNA片段的一端固定在芯片上,用芯片上的引物,以单链DNA序列为模板进行扩增,使得单链DNA成为双链DNA。该双链变性解离后成为单链一端以同样的方式固定在芯片上,另外一端随机地与附近的另外一个引物互补,在芯片上形成桥。
3. 测序
在扩增过程中加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。四种碱基底物分别标记四种不同荧光,每个碱基末端被保护基团封闭,即单次反应只能加入一个碱基,经过扫描,读取该次反应颜色。然后,除去该保护基团,以使下一个碱基的延伸反应继续进行。如此反复多轮反应,按顺序可排出DNA的序列。
 
ABI公司的SOLiD系统
ABI公司于2007年推出了新一代基因测序仪SOLiD系统,以四色荧光探针进行连续的连接反应为基础,对单拷贝扩增的DNA片段进行大规模、高通量并行测序。可用末端配对技术和双碱基编码对复杂基因组进行测序。基测序的基本原理如下:
首先设计8聚体探针,这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。
探针3’端1~5位为随机碱基,可以是ATCG四种碱基中的任何一种碱基,其中第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区,下图的双碱基编码矩阵规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜色的对应关系,而3~5位的“n”表示随机碱基,6~8位的“z”指的是可以和任何碱基配对的特殊碱基。
每一组共4种不同荧光染料标记的5′末端,通用测序引物与微珠接头序列配对,在连接酶催化下,探针竞争性地与测序引物发生连接反应。连接反的特异性是由探针中间的第1-2位碱基决定的。可视化检测连接产物发出的光,形成图像,记录碱基位置的颜色。随后切割除去含染料的末端,完成一轮连接反应测序。之后新引物(比前一个引物减少一个碱基)重新开始连接、成像、切割等过程,每轮包括5~7次连接循环,可读出DNA片段序列的25~35bp,每轮可产生超过10×108bp和数据。
由于SOLiD系统采用了双碱基编码技术,在测序过程中对每个碱基判读两遍,从而减少原始数据错误,提供内在的校对功能。这样,双保险确保了SOLiD系统原始碱基数据的准确度大于99.94%,而在15×覆盖率时的准确度可以达到99.999%,是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。
其操作流程为:
a. 文库制备:首先将基因组DNA打断,两头加上接头,制成文库。
b. 乳液PCR/微珠富集在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物,进行乳液PCR(Emulsion PCR)。PCR完成之后,变性模板,富集带有延伸模板的微珠,去除多余的微珠。微珠上的模板经过3’修饰,可以与玻片共价结合。
c. 微珠沉积:3’修饰的微珠沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中,沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。
d. 连接测序:连接反应中,这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。
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